【关键词】 胞周期蛋白类
关键词: 细胞周期蛋白类;细胞周期蛋白质依赖激酶类;表皮生长因子-尿抑胃素;真皮;成纤维细胞
摘 要:目的 探讨表皮生长因子（EGF）对作为皮肤组织工程种子细胞之一的真皮成纤维细胞中cyclinD1和CDK-4表达的影响，以从细胞周期探讨EGF促进真皮成纤维细胞生长的机制. 方法 用含100mL・L-1 胎牛血清的DMEM，加入50mg・L-1 的EGF培养SD大鼠的真皮成纤维细胞，通过MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态，免疫组化检测cyclinD1和CDK-4的表达，结合流式细胞仪分析观察细胞的周期变化. 结果 MTT检测、流式细胞仪结果都显示50mg・L-1 的EGF能显著促进真皮成纤维细胞的生长增殖，免疫组化结果显示，二者一致. 结论 50mg・L-1 的EGF对真皮成纤维细胞的生长有极大的促进作用，促进了细胞周期蛋白cyclinD1和CDK-4的表达，使细胞G1期变短.
Keywords:cyclins;cyclin-dependent kinases;epidermal growth factor-urogastrone;dermis;fibroblasts
Abstract:AIM To examine the biological behaviors of der-mal fibroblasts in DMEM containing50mg・L-1 EGF and to investigate the expressions of cyclinD1and CDK-4.METH┐ODS Dermal fibroblasts were cultured in DMEM containing50mg・L-1 EGF and100mL・L-1 fetus bovine serum.The proliferation ability was investigated by MTT detection and FCM analysis.The expressions of cyclinD1and CDK-4were investigated by immunohistochemistry method.RESULTS Dermal fibroblasts cultured in DMEM containing50mg・L-1 EGF showed enhanced proliferation and more positive signals for cyclinD1and CDK-4.CONCLUSION The dermal fi-broblasts cultured in DMEM containing50mg・L-1 EGF were in better condition than those cultured in DMEM with-out EGF.And EGF shortened the G1phase of the cell cycle.
0 引言
真皮成纤维细胞是组织工程皮肤相关的重要种子细胞，它是构成皮肤真皮的主要细胞成分，其正常的增殖、分化对于维持皮肤正常的结构和生理功能具有重要意义［1，2］ .表皮生长因子（EGF）是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原，可以促进哺乳类动物细胞进行有丝分裂和影响其某些分化过程［3，4］ ，因此，我们探讨了EGF对真皮成纤维细胞生长状态的影响，并分析了EGF对真皮成纤维细胞细胞周期相关因子表达的影响，为进一步改进其培养技术提供了一定的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基（低糖型）、表皮生长因子（EGF）、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司，培养板及培养瓶均为Falcon产品.SD仔鼠购自第四军医大学实验动物中心，Cyclin D1和CDK-4多抗购自Santa Cruz公司，LSAB增强性免疫组化试剂盒购自Dako公司.
1.2 方法
1.2.1 配制培养基 配制两种培养液:含100mL・L-1 胎牛血清的DMEM再加入50mg・L-1 的EGF（该浓度为预实验结果）和仅含100mL・L-1 胎牛血清的DMEM.
1.2.2 分离培养真皮成纤维细胞 无菌条件下取SD新生仔鼠背部皮肤，去除皮下组织，用含抗生素的PBS冲洗，将标本切成1mm×1mm×1mm大小，置于2.5g・L-1 的胰酶中，4℃放置过夜，仔细将表皮与真皮分离，将真皮放入含培养液的离心管中终止胰酶作用，反复吹打，过筛网，收集分离的细胞悬液，台盼蓝染色法行活细胞计数，用上述两种培养液以（1×105 ～1×106 ）・cm-2 密度分别接种.待细胞长满后，用2.5g・L-1 的胰酶消化传代，用上述两种培养液分成两组培养.
1.2.3 MTT检测 在96孔板上以4×103 ・cm-2 的密度接种细胞.培养3d后，每孔加入MTT（5g・L-1 ）20μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，充分振荡15min，酶联免疫分析仪测每孔A490nm 值.
1.2.4 流式细胞仪分析 取细胞5×105 个，800r・min-1 离心5min，弃上清，冷PBS洗涤2次，700mL・L-1 冷乙醇固定，4℃过夜.上机前离心去除乙醇，PBS洗涤2次，加入PI（溴化丙锭）染液1mL，4℃闭光染色30min，上机检测分析.
1.2.5 免疫组化检测细胞中CyclinD1和CDK-4的表达 细胞甩片经3mL・L-1 Triton X-100/PBS，10mL・L-1 h3 O2 /PBS处理后，正常兔血清封闭，37℃温育30min，分别滴加CyclinD1（1∶100）和CDK-4（1∶100）多抗，4℃过夜，次日晨滴加兔抗羊IgG血清，37℃温育30min，DAKO即用型二抗复合物，37℃温育30min（以上各步间均以PBS充分振洗），DAB显色，室温5min，PBS振洗中止显色反应，苏木精衬染，逐级乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片;阴性对照用PBS代替一抗，其他同前.
1.2.6 免疫组化定量分析 Cyclin D1和CDK-4在细胞中的阳性信号为覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒（Fig1～4）.用免疫组化定量系统，对正常组和实验组进行测量，每次测量前，都以统一的空白片作标准，调整系统光度值，设定的标准灰度，在同一灰度条件下，避开无细胞的区域，每张切片选择5个不同的视野，用鼠标按细胞的形态画出细胞轮廓，自动测量，选平均灰度为测量指标，放大倍数为400倍.系统设定白色最大灰度为256，黑色最小灰度为0.因此，灰度值越小，代表其阳性反映程度越高.
统计学处理:对MTT检测结果和免疫组化定量分析结果所得的数据用x ±s表示，以统计软件（Stat-graphics，Version3.0）进行两组间显著性方差分析，比较两组间的差异.
2 结果
2.1 MTT检测 培养液中加入50mg・L-1 的EGF 后，真皮成纤维细胞增殖活力增强，A490nm 为（0.550±0.008），未加入EGF组A490nm 值为（0.370±0.011），相比有显著性差异（P&<0.05）.
2.2 流式细胞仪分析 加入50mg・L-1 的EGF后，真皮成纤维细胞增殖显著，与未加入EGF组相比有显著性差异（P&<0.05，Tab1）.
表1 流式细胞仪分析结果 略
2.3 Cyclin D1和CDK┐4表达的免疫组化定量分析结果 在两组中Cyclin D1和CDK-4均有阳性表达，加EGF组的阳性表达较强，Tab2为图像分析系统对Cyclin D1和CDK-4的表达分析结果.
转贴于 表2 cyclin D1和CDK-4在皮肤成纤维细胞中的平均灰度测量值 略
3 讨论
表皮生长因子（EGF）最初是由Cohen和El-liott［5］ 从鼠的颌下腺中发现的一种小蛋白，可以刺激啮齿类动物早熟，其主要作用是促进表皮细胞生长和角质化.EGF是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原［3］ ，在促进哺乳类动物细胞进行有丝分裂和影响其某些分化过程方面与胰岛素具有相同的作用.有研究显示，EGF可以促进成纤维细胞的增殖［6］ 以及创伤愈合过程中真皮成纤维细胞的移行［7，8］ ，但是有关其与真皮成纤维细胞增殖关系的机制，目前尚未见深入报道.为此，本实验探讨了EGF对真皮成纤维细胞生长状态的影响以及其与细胞周期相关因子表达的关系.本试验在两种不同的培养基中培养大鼠的真皮成纤维细胞，结果发现:大鼠的真皮成纤维细胞在两种培养基中均能生长，但是其状态有所不同.两组细胞的贴壁速度及贴壁率相差不大，细胞形态也没有显著变化，但是MTT检测、流式细胞仪分析显示加入EGF后细胞增殖能力显著增强.
图1 －图4 略
细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自身的稳定，细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱.许多生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物对DNA代谢的调节都是通过影响细胞周期实现的.近20a来的研究越来越清楚地表明，细胞周期演进的顺序和时间对遗传信息的准确转录和表达有极为重要的作用.而细胞周期的调控机制十分复杂，主要受到3类因子的调控，即细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白（cy-clin dependent kinase inhibitors，CKIs）组成，其中细胞周期蛋白是调节亚基，CDKs是催化亚基，在调控细胞周期的进程中，常暂时结合形成复合物而发挥作用，CKIs是近年来刚分离得到的一类很重要的细胞周期的负性调控蛋白，这些蛋白在体外通过与CD-Ks，cyclins或cyclin-cdks复合物结合达到抑制CDK催化外源性底物的活性［9，10］ .D类细胞周期蛋白在细胞G1期进程中控制着G1期的时间，它们作为调节亚基，与催化亚基CDK4（或CDK6）合成复合物构成全酶而发挥其调控作用，促使细胞越过限制点，完成G1期-S期时相的转换.cyclinD1过度表达可导致细胞G1期缩短，提前进入S期，细胞周期缩短，增殖加强［11，12］ .本实验中观察到加入EGF后细胞中周期蛋白cyclinD1及其催化亚基CDK-4表达增强，同时流式细胞仪结果也显示加药后G1期细胞变少.因此，推测EGF作用于真皮成纤维细胞后，促使细胞中cyclinD1及其催化亚基CDK-4的表达增强，从而使得细胞周期缩短，增殖能力增强.
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