作者：梁英民 蒋姗姗 韩骅 刘利 孙强 陈任安 吴绒丽 杜鹃 李巧蛾
【关键词】 白血病
关键词: 蛋白转导域;融合蛋白;白血病;凋亡
摘 要:目的 研究基因重组HIV-1反式激活蛋白（TAT）的蛋白转导域（PTD）与BCR/ABL SH3结构域融合蛋白（PTD-BCR/ABL SH3）导入白血病细胞株（K562）的细胞后对K562细胞增殖、凋亡的影响. 方法 通过台盼蓝拒染法、流式细胞术、透射电镜（TEM）、激光共聚焦显微镜（CLSM）及凋亡细胞原位标记（TUNEL）等方法，测定了PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白作用于K562细胞后细胞的增殖、形态学变化、细胞凋亡和细胞周期参数的改变. 结果 ≥5μmol・L-1 的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对K562细胞生长有抑制作用，浓度越高，抑制作用越强;苔盼蓝拒染法、细胞形态学、电镜超微结构、TUNEL原位杂交和FCM检测的观察证明，PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白可引起K562细胞的凋亡和坏死;FCM检测显示该融合蛋白可将细胞阻滞在G2 /M期. 结论 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白进入K562细胞后可引起细胞凋亡和坏死，导致细胞增殖抑制.这一结果可能为慢性粒细胞性白血病（CML）的治疗提供一种新的治疗策略.
Keywords:protein transduction domain;fusion protein;leukemia;apoptosis
Abstract:AIM To investigate the effect of genetic recom-bined HIV-1TAT protein transduction domain（PTD）and BCR/ABL SH3domain（PTD-BCR/ABL SH3）fusion protein on the cell proliferation and apoptosis of K562leukemia cell line after its transduction into K562cells.METHODS The morphology，apoptosis and cell cycle of K562cells were de-tected by means of trypan-blue tropchrome cells，flow cytom-etry，transmission electron microscopy，confocal laser scan-ning microscopy and tunel in situ hybridization to investigate the changes of cell proliferation after PTD-BCR/ABL SH3fusion protein cultured with K562cells.RESULTS ≥5μmol・L-1 PTD-BCR/ABL SH3fusion protein inhibited the proliferation of K562cells and the higher the concentration of fusion protein，the stronger the inhibitory effect was.CONCLUSION PTD-BCR/ABL SH3fusion protein could induce the apoptosis and necrosis of K562cells and lead to the inhibitory proliferation of K562cells.It seems to offer a new therapeutic strategy for chronic myelogenous leukemia（CML）.
0 引言
BCR/ABL融合蛋白是一种与慢性粒细胞性白血病（CML）和部分急性淋巴细胞白血病（ALL）发生有关的特异性癌蛋白，由9号与22号染色体易位t（9∶22）（Ph染色体）形成的bcr/abl融合基因编码，BCR/ABL蛋白具有很高的蛋白酪氨酸激酶活性，在白血病转化过程中发挥着关键性的作用［1-2］ .
SH3结构域是由50多个氨基酸残基组成，存在于多种蛋白酪氨酸激酶的结构中，在c-ABL，BCR/ABL及多种转接蛋白（Adapter）和信号转导分子中含有SH3结构域，参与激酶活性的调节及信号转导［1-7］ ，已经证明c-ABL蛋白的SH3域是ABL蛋白酪氨酸激酶的负性调节域［8-10］ ，但在白血病性BCR/ABL蛋白中，SH3的结构的作用仍不完全清楚.蛋白转导域（protein transduction domain S，PTDs）是指具有能介导蛋白质跨膜转运的某些蛋白质的结构域.已经证明HIV-1的反式激活蛋白TAT的蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）能将不同大小的蛋白质（Mr 15×103 ～20×104 ）跨膜转导入细胞质内［11-13］ ，这一方法为将具有生物活性的蛋白导入细胞内提供了一项有用的技术.本研究利用PTD的蛋白转导作用，将BCR/ABL SH3域多肽模块直接导入白血病细胞系（K562）细胞中，通过细胞形态学、电镜及TUNEL等技术，证明了PTD BCR/ABL SH3融合蛋白具有抑制K562细胞增殖和诱导凋亡作用.
1 材料和方法
1.1 材料 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白为本实验室已表达和纯化的基因重组产品，方法见文献［11］，K562细胞由本室保存，TUNEL凋亡检测试剂盒购自宝灵曼公司.实验分对照组和处理组，处理组根据PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白的浓度不同又分为:10μmol・L-1 组;5μmol・L-1 组;1μmol・L-1 组和0.5μmol・L-1 组.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人慢性粒细胞白血病细胞系（K562）培养在含体积分数为100mL・L-1 的小牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，50mL・L-1 的CO2 条件下培养，每周换液2次，实验用对数生长期细胞，各组在培养不同时间后收集细胞观察，台盼蓝拒染法（trypan-blue exclusion）判断细胞活力，倒置显微镜下观察细胞生长，并用细胞涂片仪（500r・min-1 ，4min）制片，瑞氏姬姆沙染色后显微镜下观察细胞形态.
1.2.2 透射电镜观察 分别在培养12，24和48h收集培养细胞，经离心沉淀后用25g・L-1 的戊二醛-10g・L
-1 多聚甲醛混合液固定，10g・L-1 锇酸后固定，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，TEM-2000XE透射电镜下观察.
1.2.3 细胞周期分析 在培养12，24和48h收集培养细胞，PBS洗涤两次，取1×107 细胞，碘化丙锭染色后室温避光放置30min，用流式细胞仪检测细胞周期.
1.2.4 凋亡细胞原位标记（TUNEL） 检测细胞凋亡按TUNEL试剂盒介绍的方法进行，收集不同培养时间的细胞，离心甩片（500r・min-1 ，4min），用体积分数为40g・L-1 的多聚甲醛固定30min，1×10PBS冲洗后加透化液孵育2min，加入TUNEL反应混合液标记，加盖后将玻片置温盒内（37℃）60min，PBS轻洗，立即在激光共聚焦显微镜（CLSM）下观察并照相.
2 结果
2.1 PTD┐BCR/ABL SH3域融合蛋白对细胞增殖及活力的影响 K562细胞在含有不同浓度的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白的培养液中培养，不同时间收集细胞进行活细胞计数（Fig1），由Fig1可见，不同浓度的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白作用于K562细胞不同时间后可影响细胞的增殖和活力，大于5.0μmol・L-1 对K562细胞的生长有明显的抑制作用，且随着融合蛋白浓度的增加及作用时间的延长，对K562细胞的生长抑制作用增强.
图1 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白对K562细胞增殖的 略
2.2 细胞形态变化
2.2.1 倒置显微镜下观察 在5.0μmol・L-1 PTD-BCR/ABL SH3处理组，不同培养时间收集细胞观察，细胞先出现伪足，接着细胞体积缩小，随着培养时间的延长，细胞的折光性消失、逐渐出现死亡.而不同浓度的PTD-BCR/ABL SH3域融合蛋白作用于细胞后，细胞形态发生变化出现的时间不同，在大于5.0μmol・L-1 浓度的融合蛋白，随浓度增加，细胞形态变化出现越早越明显，10.0μmol・L-1 以上的浓度，培养细胞很快出现死亡.在低于5.0μmol・L-1 融合蛋白的培养中，细胞形态变化不明显.
2.2.2 光镜下观察 K562细胞经5.0μmol・L-1 的融合蛋白作用12h后，细胞开始出现形态学变化，48h后，几乎所有细胞出现凋亡和坏死的形态学改变（Fig2），表现为细胞出现伪足、胞体缩小，胞膜完整，胞质中出现空泡，核染色质浓缩，核断裂呈核小块，凋亡小体形成，坏死细胞聚集成小团片状.
2.2.3 电镜下观察 经5.0μmol・L-1 PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白的作用12h后，出现细胞凋亡的改变，可观察到细胞核固缩，染色质边集呈新月形，块状或环状，核膜完整，胞质浓缩;24h后多数细胞电子密度减低，核碎裂，胞质破裂，胞内容物外溢等细胞坏死的改变（Fig3）.
2.3 细胞周期分析 在5.0μmol・L-1 PTD-BCR/ABL SH3处理组培养时间不同后收集细胞，PBS洗涤两次，取1×107 细胞，碘化丙锭染色后室温避光放置30min，用流式细胞仪检测细胞周期.结果发现随着培养时间的延长，S期细胞的比例逐渐减少，G2 期细胞增多，细胞碎片增加，提示融合蛋白可使K562细胞阻滞在G2 期.
2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 5.0μmol・L-1 的PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白与K562细胞12h时可见细胞发生凋亡，24h时细胞凋亡数增加（Fig4）.
图2 － 图4 略
3 讨论
BCR/ABL融合蛋白由不同的蛋白结构域和氨基酸基序（motif）组成，如与Src家族同源的SH3，Sh3域和酶催化活性（SH1）域以及富含脯氨酸基序（PXXP）等［1-2］ ，不同蛋白结构域分别赋予了不同的功能，但均执行着BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶的活性.SH1是酪氨酸激酶的酶催化活性中心，具有使含有酪氨酸残基的蛋白磷酸化作用，能使下游信号转导途径激活，而SH3结构域不但能与BCR/ABL蛋白的脯氨酸基序结合，而且也参与细胞内信号转导途径的激活，对BCR/ABL蛋白激酶活性的调节和信号转导发挥了协同作用［1-6］ .
［7］ ，而在BCR/ABL蛋白的结构中含有多个脯氨酸基序（Motif）的SH3结合位点，外源性的BCR/ABL SH3多肽的导入可能与和这些位点的结合干扰了BCR/ABL蛋白的聚合有关，同时也可能阻滞了含有SH3域的信号转导分子与BCR/ABL蛋白的结合.②SH3域也是很多转接蛋白及信号转导分子的结构域，不少的转接蛋白中也具有与SH3域结合的PXXP基序［1-6］ ，导入外源性的BCR/ABL SH3结构域可能竞争性的与这些基序结合，干扰信号转导分子的激活.最近Kardinal等［5，6］ 用人工合成的具有与CRKL SH3域高度亲合的穿细胞多肽与K562细胞和原代培养的人慢性粒细胞白血病细胞培养，发现进入细胞内的多肽分子能与CRKL SH3结合，干扰了细胞内BCR/ABL-CRKL复合体的形成，抑制了MAPK活性，引起了白血病细胞的生长抑制.③在正常情况下，c-ABL蛋白主要存在于细胞的胞核内，与细胞的凋亡有关.而在CML细胞内，BCR/ABL蛋白在细胞内定位紊乱，主要分布于胞质中，发挥着抗凋亡作用.Schwarze等［12，13］ 和我们［11］ 以前实验证明了PTD转导的外源性蛋白质具有细胞核聚集的特点，最近Vigneri等［14］ 用STI571与Leptomycin B联合处理BCR/ABL转化的细胞，结果发现处理组细胞，BCR/ABL蛋白被阻滞在胞核内，从而诱导了细胞凋亡.总之PTD-BCR/ABL SH3域融合多肽引起白血病K562细胞死亡（凋亡和坏死）的机制还不清楚，值得进一步研究，然而，本研究结果说明利用蛋白转导技术，将具有多种功能的BCR/ABL SH3结构域导入细胞内的方法可作为慢性粒细胞性白血病治疗的新策略.
而另一方面，目前在对BCR/ABL融合蛋白结构与功能研究中主要采用体外转基因技术和基因剔除技术，通过去除目的基因的方法研究蛋白质的结构与功能，而PTD技术的出现可以通过增加细胞内的某些功能域的水平研究蛋白质的结构与功能，为蛋白质结构与功能研究开辟了一条新的途径.
参考文献
［1］Raitano A，Whang YE，Sawyers CL.Signal transduction by wild-type and leukemogenic Ab1protein ［J］.Biochim Biophys Acta，1997;F1333:201-216.
［2］Deininger MWN，Goldman JM，Melo JV.Molecular biology of chronic myeloid leukemia ［J］.Blood，2000;96（10）:3343- 3356.
［3］Uemura N，Salgia R，Ewaniuk DS，Little MT，Griffin JD.In-volvement of the adapter protein CRKL in integrin-mediated ad-hesion ［J］.Oncogene，1999;18（22）:3343-3353.
［4］Coutinho S，Jahn T，Lewitzky M，Feller S，Hutzler P，Peschel C，Duyster J.Characterization of Grb4，an adapter protein in-teracting with Bcr-abl ［J］.Blood，2000;96（2）:618-624.
［5］Kardinal C，Konkol B，Lin H，Eulitz M，Schmidt EK，Estrov Z，Talpaz M，Arlinghaus RB，Feller SM.Chronic myelogenous leukemia blast cell proliferation is inhibited by peptides that dis-rupt Grb2-sos Complexs ［J］.Blood，2001;98（6）:1773-1781.
［6］Kardinal C，Konkol B，Schulz A，Posern G，Lin H，Adermann K，Eulitz M，Estrov Z，Talpaz M，Arlinghaus RB，Feller SM.Cell-penetrating SH3domain blocker peptides inhibit prolifera-tion of primary blast cells from CML patients ［J］.FASEB，2000;14（8）;1529-1538.
［7］Zhang X，Subrahmanyam R，Wong R，Gross AW，Ren R.The Nh3-Terminal coiled-coil Domain and tyrosine177play impor-tant roles in induction of a myeloproliferative disease in mice by bcr-abl ［J］.Mol Cell Biol，2001;21（3）:845-853.
［8］Sicheri F，Moarefi I，Kuriyan J.Crystal structure of the Src family tyrosine kinase HCK ［J］.Nature，1997;385（6617）:602-609.
［9］Franz WMP，Berger P，Wang JY.Deletion of an N-terminal regulatory domain of the C-abl tyrosine Kinase activates its oncogenic potential ［J］.EMBO J，1989;8（1）:137-147.
［10］Jackson P，Baltimore.N-terminal mutations activate the leuke-mogenic potential of the myristoylated form of C-abl ［J］.EM-BO J，1989;8（2）:449-456.
［11］Liang YM，Sun Q，Jiang SS，Cheng P，Wang JS，Liu L，Han H.Expression of PTD-BCR/ABL fusion oncoprotein fragment carrying protein transduction domain and its transmembrane transportation ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:Cover2.
［12］Schwarze SR，Ho A，Vocero-Akbam A，Dowdy SF.In vivo protein transduction:Delivery of a biologically active protein in-to the mouse ［J］.Science，1999;285（5433）:1569-1572.
［13］Schwarze SR and Dowdy SF.In vivo protein transduction:In-tracellular delivery of biologically active protein，compounds and DNA ［J］.Trends Pharmacol Sci，2000;21（2）:45-48.
［14］Vigneri P and Wang JYJ.Induction of apoptosis in chronic myel-ogenous leukemia cells through nuclear entrapment of BCR-ABL tyrosine kinase ［J］.Nature Med，2001;7（2）:228-234.
［15］Gross AW，Zhang X，Ren R.Bcr-ABL with SH3deletion re-tains the ability to induce a myeloproliferative disease in mice，Yet C-abl activated by an SH3deletion induces only lymphoid malignancy ［J］.Mol Cell Biol，1999;19（10）:6918-6928.