作者：惠延平 黄高升 郭国祯 王映梅 马福成 朱晓慧
【关键词】 膀胱肿瘤;
关键词: 膀胱肿瘤;P-糖蛋白;脱噬作用;免疫组织化学
摘 要:目的 探讨原发性膀胱移行细胞癌P-糖蛋白（P-gp170）表达与细胞凋亡的关系. 方法 用免疫组化SP方法和凋亡细胞原位标记（TUNEL）检测了40例膀胱移行细胞癌P-gp170表达和细胞凋亡，并应用图像分析系统定量分析其凋亡指数（AI）. 结果 40例膀胱移行细胞癌P-gp170表达率为48%，组织学分级之间无显著性差异（P&>0.05）;AI随组织学分级增高而增高，各分级之间有显著性差异（P&<0.05）;AI在膀胱移行细胞癌P-gp170阳性表达组明显低于P-gp170阴性表达组，有显著性差异（P&<0.01）. 结论 原发性膀胱移行细胞癌P-gp170高表达可能抑制细胞凋亡过程致AI降低.
Keywords:bladder neoplasms;P-glycoprotein;apoptosis;immunohistochemistry
Abstract:AIM To study the relationship between the ex-pression of P-glycoprotein（P-gp170）and apoptosis in prima-ry bladder transitional cell carcinoma.METHODS In40cases with primary bladder transitional cell carcinoma，we analyzed the expression of P-gp170by immunohis-tochemistry，and detected the apoptosis by in situ apoptotic cell labeling method of TUNEL，then calculated the Apopto-sis Index（AI）by images analysis system.RESULTS Mean expression rate of P-gp170in40cases of bladder transitional cell carcinoma was48%，and no significant statistic differ-ence was found（P&>0.05）.AI in higher grade tumors were significantly higher than in lower grade tumors（P&<0.05）.AI in the P-gp170positive bladder transitional cell carcinoma group was significantly lower than that in the P-gp170nega-tive group（P&<0.01）.CONCLUSION P-gp170over ex-pression in primary bladder transitional cell carcinoma may inhibit the process of cell apoptosis.
0 引言
多药耐药性（MDR）是肿瘤化疗失败的重要原因，肿瘤细胞多药耐药基因（MDR-1）的扩增及其编码产物P-gp170的高表达是介导肿瘤MDR的主要机制［1］ .大量研究表明，P-gp170是一种能量依赖性“药泵”，可耗能将细胞内的药物泵出胞外，使胞内药物减少而无法构成对肿瘤细胞的有效杀伤［2］ .细胞凋亡（apoptosis）是由基因调控的细胞主动死亡形式，它通过消除异常细胞达到内环境的稳定，细胞凋亡也是肿瘤生长的一个重要调节因素［3，4］ .显然，肿瘤细胞的凋亡和MDR都与维持细胞自身稳定有关，两者之间有何关系?这个问题近年来逐渐受到关注［5-9］ .尽管在膀胱癌有关凋亡及MDR的研究渐有报道［2，10］ ，但关于两者之间关系的研究很少见［10］ ，为此，我们观察了40例原发性膀胱移行细胞癌P-gp170的表达并检测了其癌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），探讨膀胱移行细胞癌MDR与凋亡之间的关系.
1 材料和方法
1.1 材料 取西京医院1998-01/2000-12活检和手术切除的原发性膀胱移行细胞癌标本40（男28，女12）例，患者平均年龄48.2（28～70）岁.病理检查前均未接受过放疗和化疗.所有标本均经40g・L-1 中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，分别进行HE染色和P-gp170免疫组化染色及凋亡细胞原位标记（TUNEL法）.P-gp170mAb SP检测试剂盒及DAB显色剂均为美国Zymed公司产品（购自北京中山生物技术有限公司）.凋亡检测采用的TUNEL试剂盒（MK1020）为武汉博士德公司产品.
1.2 方法 诊断标准参照WHO1999年分级标准，其中移行细胞癌Ⅰ级14例，Ⅱ级11例，Ⅲ级15例.采用免疫组化SP方法检测标本中P-糖蛋白（P-gp170）.P-gp170mAb稀释度为1∶40，按说明书操作.以正常血清代替一抗为阴性对照，以PBS代替一抗为空白对照，以表达P-gp170的正常肾组织阳性切片为阳性对照.TUNEL标记染色按试剂盒说明书操作，反应液中不加TdT酶作为阴性对照，肿瘤中的坏死区域作为自身阳性对照.
1.3 结果判断 ①P-gp170:凡肿瘤细胞膜和/或质呈棕黄色染色者为阳性细胞.阳性细胞小于20%为（-）;阳性细胞大于20%为（+）.②TUNEL:细胞核出现棕黄色染色者为阳性细胞，同时对照HE切片，可见细胞核缩小变圆、核致密和凋亡小体出现.在显微镜400倍视野下，用HPIAS-1000高清晰度多媒体彩色病理图文分析仪进行计量分析，分别测出每个视屏中阳性细胞数和癌细胞总数.AI为阳性细胞总数与癌细胞总数之比的百分率.选择非坏死区、癌细胞分布均匀区域进行测定，并结合HE染色排除坏死细胞及其他色素沉着.每例切片随机观察5个视屏进行计数，取其均值.
统计学处理:P-gp170表达率采用χ2 检验，AI各组数值以x ±s表示，采用t检验和Student’s t检验.
2 结果
2.1 P┐gp170染色结果 P-gp170阳性染色呈棕黄色颗粒状，阳性反应颗粒均定位于癌细胞胞质及胞膜，肿瘤间质为阴性.40例膀胱移行细胞癌P-gp170表达（Tab1）.经χ2 检验，各组织学分级之间P-gp170表达率无显著性差异（P&>0.05）.
表1 膀胱移行细胞癌P-gp170的表达 略
2.2 TUNEL染色结果 TUNEL阳性染色定位于胞核，呈棕黄色.阳性细胞在癌组织中散在分布，对照HE染色切片可有或无典型的凋亡细胞形态.部分形态基本正常的细胞核中亦可见阳性颗粒沉积，认为为凋亡早期，也作为阳性细胞计数.40例膀胱移行细胞癌AI（Tab2）.经t检验AI在膀胱移行细胞癌各级之间有显著性差异（P&<0.05）.
表2 膀胱移行细胞癌的细胞凋亡指数 略
2.3 P┐gp170的表达与AI的关系 40例膀胱移行细胞癌P-gp170阳性表达组与阴性表达组的AI（Tab3）.经Student’s t检验，AI在膀胱移行细胞癌P-gp170阳性表达组明显低于P-gp170阴性表达组，两组之间有显著性差异（P&<0.01）.
3 讨论
膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，治疗后具有很高的复发倾向.其中重要原因是肿瘤产生了抗药性.大量研究证实，P-gp介导的MDR是导致化疗失败的重要机制［1，2］ .而且细胞凋亡调控机制的缺陷能引起肿瘤生长［3-5］ .有研究认为P-gp170可能具有一个原始的抗凋亡功能［11］ .Wang等［10］ 用阿霉素诱导人膀胱癌细胞凋亡，发现耐药细胞株BIU-87/ADM中细胞凋亡明显受到抑制，推测BIU-87/ADM细胞MDR形成过程可能是细胞凋亡逐渐受到抑制的过程.近年来关于MDR和凋亡的关系逐渐引起肿瘤研究的关注.有研究发现多发性骨髓瘤、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中MDR-1可能诱导凋亡和抗凋亡相关蛋白的表达［6-12］ .我们观察了原发性膀胱移行细胞癌P-gp170表达和AI，本组结果显示膀胱移行细胞癌P-gp170阳性表达率为48%.由于患者均未接受过放、化疗，故而认为膀胱癌具有较高的原发耐药性.不同组织学分级间P-gp170无显著性差异（P&>0.05），提示P-gp170表达水平与膀胱癌组织学分级无显著相关性.AI随肿瘤分级增高而增高（P&<0.05），并发现AI在P-gp170阳性表达病例组较低，而在P-gp170阴性病例组较高，两者有显著差异（P&<0.01）.这一结果提示在原发性膀胱移行细胞癌，P-gp170表达与凋亡发生存在某种内在联系，P-gp170高表达可能抑制凋亡过程致凋亡细胞数量减少.
有关肿瘤细胞MDR与AI的关系及影响机制目前尚不清楚.P-gp170在人体正常组织如空肠、结肠的柱状上皮细胞，肾远曲小管上皮细胞及肝细胞的小胆管上皮细胞等广泛分布，而肠、肾、肝是主要的排泄解毒器官，说明P-gp170具有清除外源性毒物和代谢产物的生理功能.因而，当存在某种相应刺激如毒物、药物等，均可能诱导正常或肿瘤细胞表达P-gp170.一般认为P-gp170的高表达可保护细胞耐受各种不同结构、功能及杀伤机制的多种药物的攻击，故而肿瘤细胞产生MDR可能是在应激情况下维持自身稳定的途径之一.肿瘤细胞凋亡是受基因调控的，决定于多种相关基因表达水平和相互作用.Van等［8］ 在浸润性前列腺癌的研究中发现，MDR-1与凋亡抑制基因同时增高，其癌组织高水平表达P-gp170同时具有抗凋亡的作用.认为其机制可能是P-gp170高表达增加了药物外排，减少了药物累积作用，并通过调节蛋白激酶活性，使抗凋亡蛋白如:p53，Bcl-2以及拓扑异构酶Ⅱ得以表达，癌细胞抗凋亡作用加强，细胞得以逃避死亡从而减少了凋亡的发生.推测这一作用使耐损伤的癌细胞易于获得选择性生长优势，使具有耐药表型的癌细胞得以增殖.我们认为MDR与AI均可以作为细胞恶性程度和化疗疗效指标.二者可能通过基因调控机制相互影响和制约.MDR着重防御，使细胞免受外来毒素伤害，凋亡则按基因的调控稳定自身的细胞量.MDR-1的表达产物P-gp170在原发性膀胱移行细胞癌中的高表达，提示了膀胱移行细胞癌具有原发耐药性，并认为P-gp170具有保护癌细胞免受损伤，减少凋亡的作用.其机制有待于更深入的研究.
参考文献
［1］Ling V.P-glycoprotein and resistance to anticancer drugs ［J］.Cancer，1992;60（6）:2062-2066.
［2］Guo HQ，LU CG，Xiong XL，Zhang QJ，Zhang RQ，Dong LL.P-glycoprotein expression in human bladder carcinoma ［J］.Zhongguo Zhongliu Linchuang（Chin J Cancer Clinic），1998;25（9）:649-652.
［3］Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease ［J］.Science，1995;267（12）:1456-1462.
［4］Zhou J，Xu QZ，Lu DH.Apoptosis and its correlation with ex-pressionof p53and bcl-2in astrocytic tumors ［J］.Zhenduan Binglixue Zazhi（J Diag Pathol），2001;8（2）:90-92.
［5］Fan FY，Hui YP，Zhang XL，Zhu XH.Relationship between tumor cell apoptosis and sensitivity of radiotherapy in patients with bladder carcinoma ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（8）:718-720.
［6］Dusek J，Scudla V，Kolar Z，Rihakova P，Hlobilova A.Biologi-cal characteristics of multiple myeloma ［J］.Cesk Pathol，2000;36（3）:111-115.
［7］Ramp U，Dejosez M，Mahotka C，Czarnotta B，Kalinski T，Wenzel M，Lorenz I，Muller M，Krammer P，Gabbert HE，Gerharz CD.Deficient activation of CD95（APO-1/Fas）-medi-ated apoptosis:A potential factor of multidrug resistance in hu-man renal cell carcinoma ［J］.Br J Cancer，2000;82（11）:1851-1859.
［8］Van Brussel JP，Jan Van Stcennbrugge G，Van Krimpen C，Bogdanowicz JF，Van Der Kwast TH，Schroder FH，Mickisch GH.Expression of multidrug resistance related proteins and proliferative activity is increased in advanced clinical prostate cancer ［J］.J Urol，2001;165（1）:130-135.
［9］Ogretmen B，Safa AR.Down-regulation of apoptosis-related bcl-2but not bcl-xl or bax proteins in multidrug-resistant MCF-7/Adr human breast cancer cells ［J］.Int J Cancer，1996;67（5）:608-614.
［10］Wang XW，Yang TJ，Wang ZH，He B，Jin HS，Zen Y，Liu SY.Induction of apoptosis by adriamycin in multi-drug resistant human bladder cancer cell lines ［J］.Di-san Junyi Daxue Xue-bao（J Third Mil Med Univ），1998;20（2）:128-131.
［11］Johnstone RW，Cretney E，Smyth M.P-glycoprotein protects leukemia cells against caspase-dependent，but not caspase-inde-pendent cell death ［J］.Blood，1999;93（3）:1075-1085.
［12］Smyth MJ，Krasovskis E，Sutton VR，Johnstone RW.The drug effux protein，P-glycoprotein，additionally protects drug-resistant tumor cells from multiple forms of caspase-dependent apoptosis ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95（12）:7024-7029.