作者：骆文静 王文亮 任东青 陈景元 王枫 陈耀明
【关键词】 肝细胞
关键词: 微波;p27;癌，肝细胞
摘 要:目的 观察2450MHz微波对人肝癌细胞p27mRNA表达的影响，以探讨其抑制肝癌细胞存活的分子机制. 方法 转染p27基因的人肝癌细胞按微波辐照强度不同分为对照组（未辐照组）、10mW・cm-2 ，20mW・cm-2 和30mW・cm-2 组，分别于微波屏蔽室内辐照1h后，用四唑盐比色试验（MTT）检测微波对肝癌细胞的抑制作用;同时用RT-PCR方法检测肝癌细胞中p27mRNA的表达，并进行灰度扫描后计算RNA的表达指数. 结果 微波辐照1h对肝癌细胞存活有明显的抑制作用，且呈剂量-效应关系.微波可以上调肝癌细胞中p27mRNA的表达，且与微波辐照强度有剂量-效应关系. 结论 微波可能通过上调p27mRNA的表达，从而抑制肝癌细胞的存活.
Keywords:microwaves;p27;carcinoma，hepatocellular
Abstract:AIM To observe the expression of p27mRNA in hepatocellular carcinoma cell so as to study the proliferative mechanisms of microwave radiation on hepatocellular carcino-ma cell.METHODS A hepatocellular carcinoma cell strain which can express p27protein stably was pided into control（non-irradiation），10mW・cm-2 ，20mW・cm-2 and30mW・cm
-2 groups.The four groups were radiated for1hour in a shielded room by2450MHz（continuous wave）mi-crowave physiotherapy machine.The cell proliferative effect was examined by MTT and RT-PCR was used to detect the expression levels of p27mRNA in heptaocellular carcinoma cells.Positive signals were scanned for gray density and RNA expressing index was calaulated.RESULTS The re-sults of MTT test revealed that microwave radiation could in-hibit the proliferation of hepatocellular cell line in a dose de-pendent manner.Microwave radiation could upregulate the expression of p27mRNA in a dose dependent manner.CON┐CLUSION These results indicated that the inhibitory effect of microwave radiation on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells might result from up-regulating the expres-sion of p27mRNA.
0 前言
目前，手术切除虽然仍是肝癌治疗的主要方法，但各种非手术疗法（包括肝动脉栓塞化疗、乙醇注射、冷冻、激光、微波等）的作用日益突出，微波治疗被认为是一种有前途的治疗方法.因为微波辐照可使含水量丰富、微血管交换能力差的肝癌组织在极短时间内产生高达65～100℃左右的局部高温，使肿瘤组织凝固变性坏死，达到原位灭活或局部根治的目的［1-3］ .除此之外，近年的研究还发现，微波还具有抑制细胞生长，降低细胞存活率的功能［4，5］ ，但对其抑制细胞生长的机制知之甚少.研究发现p27是一种细胞周期调控的枢纽蛋白，以多种方式调节肿瘤细胞的生长［6-8］ .为进一步探讨微波与p27mRNA之间的关系，我们借助p27基因转染的肝癌细胞模型，采用RT-PCR的方法观察了2450MHz微波辐射对人肝癌细胞p27mRNA表达的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 WKY-873Ⅲ微波抗生育医疗多用仪（国防科学技术大学研制，编号06，1989-11出厂）;人肝癌细胞株HHCC为第四军医大学病理学教研室馈赠;插有正向p27cDNA的pcDNA3-p27真核表达载体为Dr.Gilles Ponzio惠赠.大肠杆菌DH5α为第四军医大学基因所江红博士惠赠.Trizol，Lipofec-tAMINE-2000转染试剂盒和G418（Gibco公司）、DEPC（Sigma公司）寡核苷酸引物合成于上海生物工程公司.
1.2 方法
1.2.1 基因转染 获得稳定转染p27基因的人肝癌细胞株.
1.2.2 微波辐照 频率2450MHz连续波，环境温度20～22℃，功率密度分别为0，10，20和30mW・cm-2 ，连续照射1h.实验重复5次.
1.2.3 细胞毒试验（MTT法） 取对数生长期的细胞（细胞密度为1×103 ～2×104 ・L-1 ），接种于96孔培养板（200μL/孔）中.待细胞长成单层后，用WKY-873Ⅲ微波抗生育医疗多用仪辐照细胞.在对照组和微波辐照后各组细胞中加入MTT20μL/孔，37℃培养箱中放置4h，终止培养，吸弃培养孔内上清液，每孔加入150μL的二甲基亚枫，震荡摇匀，在酶标仪上测各孔A490nm 值，结果以各组5孔x ±s表示.计算其对细胞存活的毒性以抑制率来反映，其抑制率（IR）的计算公式为:细胞抑制率=A（对照组） -A（实验组）A（对照组）×100%
1.2.4 肝癌细胞株中RNA提取 将对照组和微波辐照后各组细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，按Tri-zol kit操作说明书提取的总RNA.20g・L-1 琼脂糖鉴定RNA的完整性，紫外分光光度法确定RNA的量和纯度.
1.2.5 RNA的反转录 取细胞总RNA0.8μg于20μL反应体系中进行.即RNA变性处理后加逆转录混合液（5mmol・L-1 MgCl2 2μL，RNA Buffer4μL，1mmol・L-1 dNTP2μL，RNasin0.5μL，AMV1μL，radom primer1μL，DEPC处理的双蒸去离子水8.5μL，模板RNA1μL）;反转录条件为30℃10min，42℃30min，99℃5min，逆转录产物置4℃待用.
1.2.6 寡聚核苷酸引物 根据p27cDNA序列设计合成了一对p27引物，其中上游引物为5’TCT GTA GTA GAA CTC GGG CAA3’，下游引物为5’AGTTCA AAC GTG CGA GTG TC3’，用这对引物所扩 增的产物大小为266bp.另设计一对β-微球蛋白（β-actin）引物作为内参照，其中上游引物为5’TGA CCC AGA TCA TGT TTG AG3’，下游引物为5’TCA TGA GGT AGT CAG TCA GG3’，扩增产物大小为210bp.
1.2.7 PCR反应体系及条件 取逆转录产物10μL与PCR反应液混合，终体积为50μL.反应体系中各反应成分的体积分别为:MgCl2 4μL，PCR Buffer5μL，dNTP1μL Taq DNA聚合酶1μL，2对引物各1μL（20μmol・L-1 ），DEPC处理的双蒸去离子水26μL，反转录产物10μL作模板.按以下条件扩增:94℃3min后，进入30循环即94℃1min，60℃1min，72℃1min.最后1个循环结束后72℃延伸5min.PCR产物经20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳分离，用图像分析仪对其进行灰度扫描，以p27mRNA与内对照βactin的灰度比值作为该基因RNA的表达指数，即基因表达指数=p27mRNA信号灰度值/βactin的信号灰度值.实验重复5次.
统计学分析:用SPSS10.0软件处理，实验组与对照组的比较用t检验.
2 结果
2.1 2450MHz微波对肝癌细胞存活的影响 10～30mW・cm-2 微波辐照对HHCC细胞存活有明显抑制作用，但程度不同，对癌细胞的抑制率各组均低于60%.3个实验组对肝癌细胞的抑制率随微波辐照强度的增加而增加，且呈明显的剂量效应关系.各实验组与对照组之间相比有显著性差异（P&<0.01，Tab1）.
表1 2450MHz微波对肝癌细胞存活的抑制率 略
2.2 微波辐照后p27mRNA在肝癌细胞中的表达 对照组和各实验组细胞β-微球蛋白（β-actin）的表达水平基本接近，2450MHz微波辐照对其并没有造成明显影响（Fig1）.转染p27基因的肝癌细胞即表达p27mRNA，受微波辐照后各组p27mRNA表达均有所增强，并随辐照强度的增加而增加，以30mW・cm-2 组增加最为显著.对电泳结果进行灰度扫描并计算基因表达指数（Fig2），可见，微波辐照使肝癌细胞p27mRNA的表达水平随辐照强度的增加而升高，10，20，30mW・cm-2 组辐照后p27mRNA的表达水平分别为对照组的1.20，1.63和2.03倍.各实验组与对照组相比具有显著性差异（P&<0.01）. M:DL-2000marker;1:Control;2:10mW・cm-2 ，3:20mW・cm-2 ;4:30mW・cm-2 .
3 讨论
p27kip1 是新近发现的一种肿瘤抑制基因，定位于染色体12p13.1及12p13.2，至少有两个外显子和一个内含子，由198个氨基酸组成，主要结构功能区位于N-末端;它主要是通过抑制cyclinE-CDK2，cy-clinD-CDK4，CDK6复合物的激酶活性而在G1 期、G1 -S期抑制细胞周期的传递;也可通过抑制cyclinB- CDK2的活性对G2 -M期产生抑制，由此可见其作用点较广泛，对细胞周期的抑制作用较强［7-8］ .研究表明，Rb，p16及与p27同一家族的p21具有抗凋亡的作用，而p27对细胞凋亡具有保护作用［9-11］ .由此可见p27基因可通过多个位点抑制肿瘤细胞的生长.微波是一种非电离辐射，其生物学效应及防护措施已成为医学研究领域一个新的热点.目前有很多研究关注了微波对机体细胞内基因表达的影响.Morrissey等［12］ 发现微波可引起大鼠脑内c-fos的高表达.另有研究表明，bcl-2蛋白，Ki-67抗原和p53等基因在微波辐照后表达增加［13-14］ .本室研究［4-5，15］ 表明2450MHz微波辐照1h可使体外培养的猪视网膜色素上皮细胞发生凋亡、存活率下降，认为可能是微波诱发细胞体内的脂质过氧化反应，从而使细胞发生凋亡.另一实验还发现微波辐照后，视网膜神经节细胞存活率下降［5］ .为进一步了解微波与p27的关系，我们用MTT法和RT-PCR方法检测了微波辐照对人肝癌细胞存活的抑制作用及p27mR-NA的表达水平.结果显示10～30mW・cm-2 微波对肝癌细胞的抑制率随微波辐照强度的增强而增加，且呈明显的剂量效应关系.微波辐照后各组p27mRNA的表达水平随辐照强度的增加而升高，10，20，30mW・cm-2 组辐照后p27mRNA的表达水平分别为对照组的1.20，1.63和2.03倍.各实验组与对照组相比具有显著性差异（P&<0.01）.提示微波可能通过提高细胞内p27mRNA的表达水平，从而抑制肝癌细胞的生长，但关于其抑制肿瘤细胞生长的详细机制还有待于进一步探讨.
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