关于硫芥对大鼠淋巴细胞DNA及白细胞介素的影响

作者：王仕丽，杨清武，董兆君

　　摘 要:目的 探讨硫芥中毒动物淋巴细胞的损伤特点及中毒早期白细胞介素的浓度变化作为硫芥毒性损伤诊断的可能性. 方法 分离大鼠脾淋巴细胞培养，经10～1000μmol L-1 芥子气染毒30min，以单细胞凝胶电泳法（SCG）检测DNA损伤;同时测定硫芥中毒大鼠血液IL-2和IL-6浓度. 结果 中毒后淋巴细胞DNA迁移率和受损细胞百分率呈时间和剂量依赖关系（r=0.63，P&<0.01）;培养液中IL-2和IL-6浓度明显降低，IL-6含量为（468±16）μg L-1 ，4h开始下降，72h降至（177±16）μg L-1 （P&<0.01），120h有所回升，但仍然明显低与对照（P&<0.01）.其中IL-2几乎难以检出. 结论 硫芥中毒早期机体免疫系统受到明显抑制，SCG检测DNA损伤用作评价硫芥细胞毒性指标在诊断方面具有一定价值.
　　
　　Abstract:AIM To investigate the characteristics of the lymphocytes DNA damage in rats treated with sulfur mus┐tard.METHODS Spleen lymphocytes of rats having been exposed to10～1000μmol L-1 mustard gas at37℃30min.Were isolated and DNA damages in lymphocytes at0，4，24and72h postexposure were measured with single cell gelelec-trophoresis assay（SCG）.The concentrations of IL-2and IL-6were also measured after the rats were intoxicated by Mus-tard gas.RESULTS There was a time and dose-dependent relationship between mustard gas，and DNA migration and the percentage of DNA-damaged in lymphocytes，and a sig-nificant increase in DNA-damage at10-3 mol L-1 and10-4 mol L-1 was observed after4h postexposure compared with the control group.The interleukin declined release from（468±16）μg L-1 to（177±16）μg L-1 of the lymphocytes at the early stage following mustard gas challenged（r=0.63，P&<0.01）.CONCLUSION SCG may be an indicator of cytotoxicity resulting from mustard gas，which induces im-munorepressive reaction in rats.
　　
　　0 引言
　　
　　DNA对硫芥最为敏感，是细胞毒性和基因毒性的物质基础［1］ .单细胞凝胶电泳技术（single cell gel-electrophoresis assay;SCG;or cometassay）是一种快速、简便、形象化、敏感的测定和分析细胞DNA损伤的方法［2］ .我们应用SCG检测硫芥中毒淋巴细胞DNA损伤，旨在探讨中毒后DNA损伤的规律，同时检测了硫芥中毒后淋巴细胞培养液中IL-2和IL-6浓度的变化，为进一步研究硫芥中毒细胞分子机制，提高诊断和防护水平提供理论依据.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 离心机，细胞培养箱，电泳仪，荧光显微镜及其照相系统，接目测微器、镜台测微器.硫芥由军事医学科学院毒物药物研究所提供，纯度97.5%，先用1，3-丙二醇配成10m mol L-1 母液，临用时用PRMI1640培养液稀释所需浓度;淋巴细胞分离液.
　　1.2 方法 大鼠脾淋巴细胞分离培养，取Wistar大鼠无菌剖腹取脾剪碎，加适量RPMI1640培养液，100目尼龙网过滤，等量培养液洗3次，1000r min-1 离心5min.弃上清，加入适量培养液制成脾细胞悬液，后用淋巴细胞分离液分离，2000r min-1 离心20min，吸取中层云雾状液面层，适量培养液洗3次.用台盼蓝测细胞活性&>95%，调整细胞计数109 个 L-1 .50mL L-1 CO2 ，37℃孵箱培养24h备用.分别将所需硫芥浓度加入培养瓶中（20mL培养液）各3mL，室温染毒30min后，离心换液，继续培养至所需时间，分别于0，4，24和72h中毒模型取样作SCG检测，参照文献［3］方法略加改进.动物随机分为正常对照组、低毒组（0.5LD50 =1.60mg kg-1 ）和高毒组（0.8LD 50 =2.70mg kg-1 ）各组动物分别于中毒后4，24，72和120h不同时相点活杀分离培养淋巴细胞.用放免试剂盒方法测定培养液中IL-2，IL-6浓度.
　　
　　统计学处理:统计学分析以SPLM程序.选用方差齐性分析及t检验.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 受损淋巴细胞百分率 硫芥中毒4h，受损细胞百分率在1m mol L-1 （A），0.1m mol L-1 （B）剂量组分别与对照组相比均显明显增高，差异显著（P&<0.01，Fig1），而10μmol L-1 （C）则无明显改变.在中毒24，72h，3个剂量组都明显增高.经方差齐性和t检验结果显示受损淋巴细胞百分率呈时间、剂量依赖关系.同时随芥子气中毒剂量增大，淋巴细胞受损率增高时间前移.
　　
　　图1 略
　　
　　2.2 淋巴细胞DNA迁移度 中毒4h，DNA迁移度在10m mol L-1 （A），0.1m mol L-1 （B）剂量组分别与对照组相比均已增高，差异显著（P&<0.01，Fig2）;10μmol L-1 （C）却无明显差异.在中毒24，72h继续增高.至72h，10-3 则达到对照组2倍以上.经方差齐性和t检验显示DNA迁移度与硫芥呈良好的时间、剂量依赖性，表明随着受损淋巴细胞百分率的增高，DNA的迁移度也呈明显增高. 　2.3 白细胞介素浓度变化 中毒4h即明显降低（P&<0.01），1和3d其含量降低已超出试剂盒检测灵敏度范围无法取得数据，5d逐渐恢复但IL-2含量与对照组比较仍明显差异（P&<0.01）.对照组大鼠培养 淋巴细胞上清液中IL-6含量为（468±16）μg L-1 ，0.8LD50 硫芥中毒后4h开始下降，72h降至（177±16）μg L-1 （P&<0.01），120h有所回升，但仍然明显低于对照（P&<0.01）.
　　
　　图2 略
　　
　　3 讨论
　　
　　在内外因素致核DNA断裂时，会在核外形成一个DNA晕轮，DNA断裂将引起超螺旋松解，电泳时DNA断片向阳极伸展，形成特征性彗星现象.DNA受损伤越严重，含片断越多，彗星中彗尾就越长.因此尾中DNA百分含量和尾长就成了DNA断裂的重要定量参数.彗星长度（代表DNA迁移率）与受试物引起的DNA断裂程度呈正相关.测量DNA迁移距离可定量反映DNA损伤的程度.未受损细胞表现为圆形荧光核心，无尾.在高pH的碱性条件下电泳，使得DNA中碱不稳定部位和单链断裂更易展现，提高了该法的敏感度，使SCG法或为检测单个细胞DNA单链断裂和碱不稳定损伤的一种快速简便、灵敏的技术.研究显示，硫芥作用浓度与DNA单链断裂有量效关系［4］ .淋巴细胞对硫芥极为敏感，中毒4h，高、中剂量组淋巴细胞DNA损伤有明显改变.淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2，IL-6在硫芥中毒后的含量变化趋势与细胞数量变化一致.本结果表明硫芥中毒后由于淋巴细胞分泌IL-2，IL-6下降，反映了机体免疫功能的抑制［5］ .硫芥对DNA损伤实际上是一个损伤和修复的过程［6］ .在早期中毒可能修复对抗了损伤，虽DNA有损伤而细胞却无死亡，或者是DNA损伤的程度未达到引起细胞死亡的程度.低剂量组在中毒4h，DNA损伤无明显改变的原因也可能是修复对抗了损伤.正因为该方法检测硫芥中毒DNA损伤敏感，而且其损伤呈良好的时间、剂量依赖性，所以作为评价其细胞毒的指标，在早期诊断中也有一定意义.
　　参考文献:
　　
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　　［3］Sasaki YF，Fujikawa K，Ishida K，Kawamura N，Nishikawa Y，Ohta S，Satoh M，Madarame H，Ueno S，Susa N，MatsusakaN，Tsuda S.The alkaline single cell gel electrophoresis assay with mouse multiple organs ［J ］.Mutat Res，1999;440（1）:1-18.
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