作者：王红英 辛晓燕 马越云 苏明权
【关键词】 卵巢肿瘤
关键词: 卵巢肿瘤;端粒，末端转移酶;核糖核酸酶类;转染
摘 要:目的 研究端粒酶RNA特异性核酶对卵巢癌细胞活性的抑制作用. 方法 用脂质体法将构建好的核酶逆转录病毒载体转染至卵巢癌HO-8910细胞，以MTT比色法检测细胞的生长，应用流式细胞仪分析细胞周期细胞，观察细胞的增殖情况，同时扩增端粒重复序列，结合杂交分析，检测细胞的端粒酶活性. 结果 MTT检测发现转染核酶后的细胞生长的潜伏期延长（48→72h），对数生长期减缓（4→5d），流式细胞仪结果显示其G1期比例明显增高（70.0%→80.5%，P&<0.01），S期细胞比例明显降低（19.0%→13.7%，P&<0.01），细胞增殖下降，细胞的端粒酶活性亦降低. 结论 端粒酶RNA特异性核酶能抑制卵巢癌细胞端粒酶活性，抑制细胞增殖.
Keywords:ovarian neoplasms;telomere，terminal trans-ferase;ribonucleases;transfection
Abstract:AIM To explore the effects of hammerhead ri-bozyme against human telomerase RNA in ovarian carcinoma cells.METHODS We transfected the ribozyme directed a-gainst the RNA component of human telomerase into HO-8910，human ovarian carcinoma cells.Then we observed the propagation of the cells with MTT，analyzed cell cycle phases under FCM and detected their telomerase activity by TRAP-Hyb Kit.RESULTS After transfection，we found that the latent period of the transfected cells prolonged（48→72h）and the logarithm growth period also lengthened（4→5d）.FCM showed that cells in G1phase increased obviously（70.0%→80.5%，P&<0.01）and decreased obviously in S phase（19.0%→13.7%，P&<0.01）.The propagation of the cells was inhibited and the telomerase activity was reduced.CONCLUSION Telomerase ribozyme inhibites the telom-erase activity in ovarian carcinoma cells.
0 引言
核酶（ribozyme，RZ）通过合理的设计及操作，特异地剪切靶RNA，可以作为治疗人类恶性肿瘤的手段之一［1，2］ .Li等［3］ 利用逆转录酶抑制剂对卵巢癌细胞作用后发现细胞端粒酶活性明显抑制，细胞的G2 /M期DNA含量明显升高.研究表明，针对端粒酶的肿瘤基因治疗可能是一条有效的治疗肿瘤的新途径.我们研究核酶对卵巢癌细胞端粒酶活性的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 卵巢癌细胞系HO-8910由本室保存;脂质体购于Life Technologies公司;生物素标记试剂盒购于NEB公司;胎牛血清、G418、四唑盐（MTT）、亲和素、生物素标记辣根过氧化物酶、端粒酶活性检测试剂盒（TRAP-Hyb Kit）均购于华美生物工程公司;真核表达载体pcDNA3由西京医院临床分子实验室提供.端粒酶特异性核酶由西京医院临床分子实验室构建，经全自动序列分析仪检测序列正确.针对hTR模板区设计一锤头状核酶，人工合成后，重组至克隆载体，酶切鉴定及序列分析检测正确，酶切回收后，定向克隆入真核表达载体pcDNA3，酶切鉴定序列正确.
1.2 方法 用含100mL L-1 胎牛血清，1×105 U L-1 青霉素和1×105 U L-1 链霉素的1640培养基，37℃，50mL L-1 CO2 孵箱培养卵巢癌HO-8910细胞.脂质体介导的基因转染参照试剂说明书进行:细胞分成3组:①试验组:HO-8910细胞转染核酶载体-HO-8910/pRZ;②阴性对照:HO-8910细胞转染空的pcDNA3-HO-8910/pcDNA3;③空白对照:HO-8910细胞.将处于良好生长状态的HO-8910细胞接种在6孔板中，加入100mL L-1 1640培养基2mL，37℃，50mL L-1 CO2 培养至细胞50%汇合时供转染使用.转染前先吸弃培养液，用不含血清及抗生素的培养液洗细胞1次，加入脂质体-DNA复合物（每孔含培养液1mL，脂质体10μg，质粒DNA2μg），于37℃，50mL L-1 CO2 孵箱中培养5h，加含200mL L-1 胎牛血清的培养液1mL继续培养18～24h，更换新的100mL L-1 1640培养基，继续培养24～72h，用含1g L-1 G418的完全培养液培养，进行细胞筛选.提取细胞的RNA，以生物素标记核酶的cDNA链作为探针，进行斑点杂交检测细胞内转录情况.用四唑盐比色试验检测细胞活力，参照文献［4］进行.细胞端粒酶活性检测参照端粒酶TRAP-Hyb Kit说明书进行.样本A490nm 值大于或等于阴性对照A490nm 值的2.1倍时，为端粒酶活性阳性.阴性对照为同体积裂解液加入反应.收集转染后第3代细胞（5×105 ），1000r min-1 离心10min，0.01mol L-1 ，pH7.3PBS洗1次，加入1mL-20℃预冷的700mL L-1 乙醇固定，4℃过夜.次日用0.01mol L-1 PBS洗1次，加入PI300μL染色30min，在ELITE-流式细胞仪上测定细胞周期.
统计学方法:μ检验.
2 结果
HO-8910/pRZ细胞斑点杂交显示转染成功（Fig1）.细胞活力检测结果表明试验组细胞的潜伏期及对数生长期分别为72h及5d，对照组为48h及4d.实验组细胞的潜伏期延长，对数生长期明显减慢（Fig2）.各组细胞A490nm 值分别为:阴性对照0.056，阳性对照0.119，HO-8910/pRZ细胞0.105，HO-8910/pcDNA细胞0.141，HO-8910细胞0.163.分别为阴性对照的1，2.13，1.88，2.52及2.91倍，结果判定分别为:HO-8910/pRZ细胞为阴性，HO-8910/pcDNA细胞及HO-8910细胞为阳性.HO-8910/pRZ细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，转染空载体的细胞（HO-8910/pcDNA3）端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显.流式细胞仪检测结果表明HO-8910/pcDNA3细胞中处于G1期，S期的细胞比例分别为70.0%和19.0%，HO-8910/pRZ细胞分别为80.5%和13.7%.核酶作用后，G1期细胞比例明显增高，S 期细胞比例明显降低（P&<0.01）.细胞的分裂、增殖受到明显抑制.
3 讨论
核酶为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段［4］ .Duggan等［5］ 报告，端粒酶阳性预测肿瘤细胞存在的敏感率达88%.Novakovic等［6］ 检测卵巢癌端粒酶RNA敏感率为71.4%.抑制端粒酶的活性成为治疗肿瘤的可能途径，Du等［7］ 通过端粒酶催化亚单位（hTERT）基因的反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞的端粒酶活性;Zhang等［8］ 应用反义端粒酶RNA有效抑制了肝癌细胞的端粒酶活性同时显著促进细胞凋亡.我们将针对hTR模板区的锤头状核酶，转染至卵巢癌细胞HO-8910后，发现细胞的端粒酶活性明显降低，活力明显减弱，细胞的分裂增殖明显抑制，与其对宫颈癌细胞及内膜癌细胞的作用结果一致.本结果提示端粒酶特异性核酶明显抑制卵巢癌细胞的增殖，为进一步开展卵巢癌的基因治疗奠定基础.
参考文献:
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［2］Fan YD，Li KZ，Zhao YT.The morphological transform of apoptosis in human cholangiocarcinoma cells induced by bcl-mR-NA-cleaving ribozyme ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:324-327.
［3］Li HM，Xin XY，Du H，Wang J，Wang DT.AZT inhibits telomerase activity of tumor cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（2）:119-121.
［4］Perry PJ，Arnold JR，Jenkins TC.Telomerase inhibitors for the treatment of cancer:The current perspective ［J］.Expert Opin Investig Drugs，2001;10（12）:2141-2156.
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［6］Novakovic S，Fras PA，Jezersek-Novakovic B.Telomerase ac-tivity as a biological marker in some gynecological tumors:Com-parison with tissue and serum CA125［J］.In Vivo，2001;15（4）:327-332.
［7］Du H，Xin XY，Wang J.Attenuation of telomerase activity by an antisense oligonucleotide against hTERT mRNA in ovarian cancer cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:366-368.
［8］Zhang CS，Wang WL，Huang GS，Liu L，Hu PZ，Ma FC，Zhu XH.Effect of antisense telomerase RNA on SMMC7721［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（18）:1637-1640.