关于TNP┐470对结肠癌Lovo细胞生长的抑制作用

【关键词】 结肠肿瘤
　　关键词: TNP-470;Lovo细胞;脱噬作用;结肠肿瘤
　　摘 要:目的 探讨TNP-470对体内外人结肠癌Lovo细胞生长的影响. 方法 采用MTT法检测TNP-470对体外培养的Lovo细胞的生长抑制作用.建立结肠癌皮下移植瘤模型，16只裸鼠平均分为治疗组（TNP-47030mg kg-1 ）和对照组（相同体积的生理盐水），4wk后处死裸鼠，测量肿瘤体积.肿瘤组织行病理学检查，采用HE染色和TUNEL原位末端标记术检测体内肿瘤细胞的凋亡情况. 结果 TNP-470作用72h，明显抑制体外培养的Lovo细胞的生长，IC50为55.8μg L-1 .TNP-470显著抑制了体内肿瘤的生长，治疗组肿瘤体积为（731±40）mm3 ，对照组为（1345±38）mm
3 ，（P&<0.01）.治疗组Lovo细胞凋亡率为（21.4±2.1）%，对照组为（7.5±1.5）%，（P&<0.001）. 结论 TNP-470能够抑制结肠癌Lovo细胞的体内外生长，其机制可能与诱导细胞凋亡有关.
　　
　　Keywords:TNP-470;Lovo cells;apoptosis;colonic neo-plasms
　　
　　Abstract:AIM To study the effect of TNP-470on the growth of human colon cancer cell line，Lovo cells，in vitro　and in vivo.METHODS Growth inhibitory effect of TNP-470on Lovo cells was examined by an MTT assay.Human colon cancer xenografts was transplanted into16nude mice.TNP-470（30mg/kg）or the same volume of saline solution was administered on alternative day starting1days after tu-mor implantation.Mice were sacrificed after4weeks and tu-mors were processed for histological examination.In both the treatment and control groups，tumor volumes were counted and apoptoses of Lovo cells were measured using HE staining and TdT-mediated biotinyated-dUTP nick end labeling（TUNEL）method.RESULTS In vitro，TNP-470inhibited the growth of Lovo cells，with it’s IC50at55.8μg L-1 .In vivo，tumor volumes ［（1345±38）mm3 vs（731±40）mm3 ，P&<0.01）］were significantly reduced in the TNP-470group compared with the control group.Apoptosis indexes（AI）of Lovo cells were statistically different between the two groups ［（21.4±2.1）%vs（7.5±1.5）%，P&<0.001）］.CONCLU┐SION TNP-470is a potent agent to inhibit tumor growth of colon cancer in vitro and in vivo and this inhibitory effect may be associated with apoptosis.
　　
　　0 引言
　　
　　血管生成抑制剂TNP-470通过抑制血管内皮细胞生长和迁移，进而抑制肿瘤新生血管形成.TNP-470还能抑制体外培养的多种肿瘤细胞的生长，但对于TNP-470抑制肿瘤细胞生长的机制，研究结果不尽相同.我们通过MTT法检测TNP-470对结肠癌Lovo细胞的生长抑制作用，采用裸鼠皮下移植瘤模型，观察TNP-470对移植瘤生长及Lovo细胞的凋亡的影响，探讨TNP-470抗瘤作用的机制.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 雌性4wk龄BABL/c裸鼠，体质量17～22g，第一军医大学动物实验中心提供.结肠癌Lovo细胞株由第一军医大学消化研究所传代保存.RPMI1640培养基、胰蛋白酶、新生小牛血清等均购自杭州四季青生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，原位末端标记（TUNEL）试剂盒购自基因公司.TNP-470由日本大阪Takeda化学公司Hiroshi Fukui博士惠赠.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 Lovo细胞增殖抑制实验 采用MTT法检测TNP-470对LOVO细胞生长抑制率.将对数生长期的Lovo细胞置96孔培养板中培养，48h后实验组加入不同浓度的TNP-470（5×10-4 ～5×105 μg L-1 ），每个浓度设6个复孔，对照孔加入相同体积不含TNP-470的RPMI1640培养基，并设空白对照孔（无细胞，仅含RPMI1640培养基）.培养72h后，每孔加入MTT（5g L-1 ）20μL，37℃反应4h，小心吸去孔内培养液，再加入150μL二甲亚砜（DMSO），充分溶解后在Bio-Rad550型酶标仪570nm下测吸光度（A）值.按下列公式计算细胞生长抑制率:生长抑制率（%）=（对照组平均A-实验组平均A）/（细胞对照组A-空白对照组A）×100%.
　　
　　1.2.2 皮下移植瘤抑制实验 收集培养3d的Lovo细胞，生理盐水制成悬液，用1.0mL微量注射器将0.2mL细胞悬液（5×106 ～5×107 ）注入2只裸鼠颈部皮下.注射前注射部位消毒，4d后重复接种1次.当接种部位肿瘤长至15～20mm时，无菌条件下取材.将肿瘤组织剪成1.5～2.0mm小块，置于生理盐水中备用.裸鼠以20g L-1 氯胺酮0.2～0.3mL麻醉成功后，乙醇消毒接种部位皮肤，将切好的肿瘤组织块置于18号套管针口，分批接种于裸鼠背部皮下.16只裸鼠随机分成2组，两组裸鼠体质量差异无显著性.手术当天给药，TNP-47030mg kg-1 ，sc，qod，对照组给相同体积的生理盐水.接种30d后断颈处死裸鼠，测量肿瘤体积，计算抑瘤率.将肿瘤组织于40g L-1 中性甲醛固定24h，石蜡包埋，连续切片（4μm），常规HE染色及TUNEL标记染色.抑瘤率（%）=（对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/对照组肿瘤体积×100%.
　　
　　1.2.3 TUNEL染色检测凋亡细胞 TUNEL染色具体步骤如下:切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水至水化，滴加20mg L-1 蛋白酶K，室温消化15min，去离子水洗5min×2，30mL L-1 过氧化侵氢甲醇液中室温下封闭10min，0.05mol L-1 PBS洗5min×2，向组织片滴加平衡缓冲液，室温下孵育60min，滤纸吸取标本周围液体，迅速滴加TdT酶，置湿盒中37℃孵育60min，室温下切片入终止缓冲液中振荡孵育10min，0.05mol L-1 PBS洗2min×3，滴加过氧化物酶，室温下湿盒中孵育30min，0.05mol L-1 PBS洗2min×4，DAB显色5～10min，甲基绿复染10min， 脱水、透明、封片.以0.05mol L-1 PBS替代TdT酶作为阴性对照.
　　
　　结果判定:以细胞核阳性为标准，凋亡细胞呈棕黄色细颗粒状或弥散性，散在或簇状分布于肿瘤组织中，个别者核膜增厚，呈棕黄色染色.结合HE染色，选择无细胞坏死的5个视野或HE染色证实为坏死的细胞不计数，采用德国Kontron IBAS2.5型全自动图像分析系统对TUNEL染色阳性细胞进行计数，每个视野计数1000个以上细胞，以阳性细胞所占百分率作为凋亡指数（apoptosis index，AI），取5个视野AI均值进行统计学分析.
　　
　　统计学处理:所有数据采用均数±标准差（x ±s）表示，均数间比较用t检验，采用Spss10.0统计软件分析. 转贴于 　2 结果
　　
　　2.1 细胞形态及MTT检测 随着TNP-470浓度的增加，梭形Lovo细胞逐渐变小变园，间隙增宽，细胞内颗粒增多，折光度下降，培养48h后未见细胞密度明显增加，大部分细胞仍贴壁生长，少部分漂浮于培养液中.从Lovo细胞生长抑制率曲线可以看出，TNP-470的抑制作用存在量效倚赖关系，回归分析得出72h的IC50为55.8μg L-1 （Fig1）.
　　
　　图1 略
　　
　　2.2 肿瘤体积 两组裸鼠皮下移植瘤在移植12d后生长明显，但TNP-470组肿瘤在20d后生长几乎处于停滞状态，体积未见明显增加.最终对照组皮下瘤体积为（1345±38）mm3 ，TNP-470组为（731±40）mm3 ，两组肿瘤体积差异有显著意义（P&<0.01），抑瘤率达45.6%（Fig2）.
　　
　　2.3 TUNEL染色结果 对照连续切片HE染色（Fig3A），镜下凋亡细胞TUNEL染色表现为细胞核呈棕黄色染色.阳性反应产物在凋亡细胞内呈不均匀分布，近核膜处着色较深，核中央着色较浅，核固缩则染色质呈块状集聚.有的细胞核固缩不明显，整个细胞呈浅棕黄色，可能是细胞处于凋亡早期，未凋亡细胞的胞核为蓝绿色（Fig3B）.治疗组肿瘤细胞凋亡率为（21.4±2.1）%，对照组为（7.5±1.5）%，差异有显著意义（P&<0.001）.
　　
　　图2 略
　　
　　3 讨论
　　
　　目前研究表明，血管生成是恶性肿瘤迅速生长、转移、扩散的主要条件之一［1］ .恶性肿瘤生长转移的血管依赖性也提示:通过抑制肿瘤的血管生成可以有效的防治肿瘤的生长、浸润和转移［2］ .结直肠癌是消化道常见肿瘤，自20世纪70年代以来，结直肠癌发病率在我国逐渐上升［3］ .我们利用血管抑制剂TNP-470观察其对实验性结肠癌的治疗效应.实验表明，TNP-470对体外培养的人结肠癌Lovo细胞的生长有较强抑制作用，抑制作用呈量效依赖关系.
　　
　　Yakmamoto等［4］ 观察到TNP-470可诱导5种乳腺癌细胞（MDA-MB-231，T-47D，MCF-7，KPL-1，MKL-F）凋亡，并检测到促凋亡蛋白Bax，Bcl-xS表达明显增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2，Bcl-xL的表达显著下降.动物实验也表明，TNP-470抑制肿瘤生长的同时，肿瘤细胞凋亡显著增加
［5，6］ .因此TNP-470的体内抗瘤效应是通过抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡双重作用实现的.我们采用TUNEL染色法检测肿瘤组织中Lovo细胞的凋亡情况，镜下观察到TNP-470组有大量的肿瘤细胞核被染成棕黄色，凋亡细胞在肿瘤组织中弥散分布，而HE对照染色典型凋亡细胞较少，可能是部分细胞处于凋亡早期.我们结果表明，TNP-470对体内外结肠癌Lovo细胞的生长有较强的抑制作用，该作用可能与TNP-470诱导Lovo细胞凋亡有关.实验结果也提示:对于血管形成期的肿瘤，TNP-470可通过抗血管生成作用抑制肿瘤的生长和转移.
　　
　　图3 略　
　　参考文献:
　　
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　　［2］Liu DH，Zhang XY，Huang XY，Fan DM.VEGF165antisense gene and biological characteristics of human gastric cancer cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（9）:821-824.
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　　［4］Yamamoto D，Kiyozuka Y，Adachi Y，Takada H，Hioki K，Tsubura A.Synergistic action of apoptosis induced by eicos-apentaenoic acid and TNP-470on human breast cancer cells ［J］.Breast Cancer Res Treat，1999;55（2）:149-160.
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