关于大鼠传代培养肝细胞的形态学观察

【关键词】 肝/细胞学
　　关键词: 肝/细胞学;连续传代培养;显微镜检查，电子;大鼠
　　摘 要:目的 将大鼠肝细胞进行传代培养，并观察其形态学特点. 方法 采用胶原酶二步法灌注1mo龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养，对其形态学进行了观察. 结果 肝细胞已传7代，每次传代培养6d左右，光镜下可见大量新生肝细胞生长，呈多边形，相嵌紧密排列.电镜下可见核变形，有的为双核细胞.此外，胞质内的糖原颗粒也逐渐减少. 结论 成功进行了肝细胞的传代培养，为肝细胞的研究提供了一种方便的研究方法.
　　
　　Keyword:iiver/cytology;serial passage;microscopy，elec-tron;rats
　　
　　Abstract:AIM To subculture rat hepatocytes and to ob-serve their morphological characteristics.METHODS Hepa-tocytes were isolated from1-month-old rats by two-step col-lagen perfusion.After cultured for20d，the primary culture-sof hepatocytes were separated with trypsin and then subcul-tured for7generations whose morphological characteristics were studied.RESULTS Six days after the subculture，hep-atocytes were observed under light microscope，and a great number of neoformative polygon hepatocytes were found.They were closely arranged.The nucleus of subcultured hep-atocytes became deformed under TEM.Some of them were binuclear.Besides，glycogen in the cytoplasm decreased.CONCLUSION Subculture rat hepatocytes provide a conve-nient method for the study of hepatocytes.
　　
　　0 引言
　　
　　在研究体外肝脏多种多样的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.1969年Berry和Friend用胶原酶灌注分离细胞，使细胞产量大幅度提高，这些细胞具有许多肝脏功能.我们在肝细胞原代培养的基础上，又成功地进行了肝细胞的传代培养，以利于肝细胞的研究.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 上海产1mo龄SD雄性大鼠，体质量90～100g.DMEM培养基（Gibco公司），0.3g・L-1 Ⅰ型胶原酶溶液5.0mL（Sigma公司，DMEM为溶剂），磷酸缓冲液（PBS）250mL，RDB-TB蠕动泵（江苏省张家港市仪表仪器总厂），离心机，型号为Biofuge15R（德国Heraeus公司）.
　　
　　1.2 方法 SD雄性大鼠腹部消毒后按2mL・kg-1 ，ip，10g・L-1 戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定.脱去胸腹部毛，消毒，无菌操作下，开胸将导管插入下腔静脉胸段，丝线固定.开腹显露门静脉，远离肝脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处，剪破门静脉近肝脏处，以9mL・min-1 速度灌注PBS15min，以8mL・min-1 速度灌注Ⅰ型胶原酶溶液10min，收集细胞于DMEM中，依次经100，150，180，280，400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃，50g离心2min，弃上清，反复离心3次，沉积的细胞用含100mL・L-1 小牛血清DMEM调整细胞密度为2×108 ・L
-1 ，台盼蓝拒染法测细胞活力0.90，以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞4×105 /孔.36h后首次换液，以后每48h换液1次.肝细胞培养20d时，于位相差倒置显微镜下可见细胞融合成片.传代前用无血清培养基培养1d，弃去培养液，加入1.25mL・L-1 胰蛋白酶（1mL/孔）于37℃作用6min，镜下见胞质回缩，细胞间隙增大.此时吸去胰蛋白酶加入含100mL・L-1 小牛血清DMEM，吸管轻轻反复吹打培养皿底部，调整细胞密度为2×108 ・L-1 .台盼蓝拒染法测细胞活力为0.98，重新接种于新的培养皿进行传代.在位相差显微镜下观察培养6d的各代肝细胞形态并拍照.经首次传代培养6d的肝细胞，吸出培养液，加入1.25mL・L-1 胰蛋白酶于37℃下作用8min，吸去胰蛋白酶，加入含100mL・L-1 小牛血清DMEM，吸管轻轻吹打培养皿底部，细胞悬液收集于锥形离心管中，以2000r・min-1 速度离心10min，沉积物加入戊二醛固定，常规包埋，切片，染色，于透射电镜下观察并摄像.细胞计数与活力检测:细胞培养过程中用台盼兰拒染法检测培养细胞活力，用血球技术板计算细胞数.
　　
　　2 结果
　　
　　肝细胞传代培养6d，可见新生肝细胞大量生长，呈多边形，相嵌紧密排列.细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，亦无细菌及真菌污染.培养中抽查细胞活力为0.98，现已传7代（Fig1）.传一代肝细胞在电镜下可见核变形，有的为双核，细胞膜上有大量微绒毛（Fig2）.胞质内有丰富的细胞器，如大量的内质网和线粒体，其中有典型的车轮状线粒体，大量玫瑰花瓣型糖原颗粒，还有溶酶体等细胞器（Fig3）.
　　
　　图1 略
　　
　　3 讨论
　　
　　在研究体外肝脏多种多样的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.细胞培养技术便是最常用的方法［1-4］ .我们先前已经建立了长期培养的细胞系［5］ ，而肝细胞的传代培养，更有利于肝细胞的研究.肝细胞培养数周后，肝细胞就被一种含有透明细胞质的小细胞替代.这种细胞具有上皮样改变，且可传代.虽然这种细胞与原来的肝细胞形态略有不同，却具有典型肝细胞的多项功能特征.他们具有较高水平的γ-谷氨酰转肽酶，可合成Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原，具有胰岛素和EGF受体，其水平分离的肝细胞水平相似，可以合成和分泌多种血清
蛋白，如白蛋白、转铁蛋白、甲胎蛋白.当它们被化学致癌物转变或移植回同源宿主中，可以产生胆管腺癌或肝细胞癌，这提示肝细胞、胆管上皮细胞和培养的肝上皮细胞是紧密相关的，同时也支持了有关胚胎学中肝细胞是从终胆管演化而来及病理情况下胆管上皮细胞和肝细胞可以相互转变的研究. 　　在大鼠肝细胞培养过程中胰岛素具有重要作用，可增加细胞接种有效率，促进核蛋白磷酸化.新接种的细胞加入10mg・L-1 胰岛素作用3h，就足以使核蛋白磷酸化增加并持续3d.胰岛素还可以结合到生长因子受体上，具有潜在的特异性生长因子样作用.它还可以增加球蛋白的合成、糖原合成、脂肪生成及DNA合成，诱导许多酶如乙酰-辅酶A羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡萄糖激酶，ATP枸橼酸盐裂解酶，酪氨酸转化酶及鸟氨酸脱羧酶.其中鸟氨酸脱羧酶只有在胰岛素与EGF协同作用下才能诱导合成.皮质类固醇可显著增加大鼠肝细胞生存率，维持其多边形上皮形态，尽管这种激素作用的生化基础还不清楚，很可能与皮质类固醇对蛋白水解酶的抑制作用有关.皮质类固醇可促进胆小管形成，增加可促进细胞贴附的粘接蛋白的合成.最新资料显示ED-A（+）细胞粘接蛋白与肝细胞激活，肝脏纤维化密切相关［6-8］ .YTIYVIAL序列存在于粘接蛋白的肝2区，它具有抑制各种细胞与粘接蛋白粘附的作用，此抗粘点深埋与血浆粘附蛋白的肝2区结构内，肝素与基质金属蛋白酶2（MMP-2）的降解产物与粘接蛋白相互作用可使其暴露［9］ .MMPs是肝脏受到炎性损伤时的产物［10］ .粘接蛋白多肽含有这种抗粘附YTIYVIAL序列.人工合成的多肽FNⅢ14可抑制细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化以调节细胞生长、分化等过程［11］ .ED-A（+）细胞粘接蛋白作为细胞固定的骨架可诱导肌纤维细胞的转化，尽管其机制尚不完全清楚.由于肝细胞可表达α5β1，而其与细胞粘接蛋白的粘附可被合成的粘接蛋白多肽GRGDSP阻断，因此肝细胞似乎是通过α5β1与ED-A（+）细胞粘接蛋白粘附的［12］ .
　　
　　图2 － 图3 略
　　
　　肝细胞传代过程中胰酶消化非常重要.浓度过 大，时间过长，容易损伤肝细胞;浓度太小，时间过短，肝细胞分散不够理想，且细胞量少.若用吸管吹打培养皿底部促使细胞分离，也会损伤细胞.本实验用胰蛋白酶在37℃下作用6min，既可使肝细胞充分分离，又不损伤肝细胞，传代后肝细胞也容易贴壁生长.传代肝细胞电镜下与原代肝细胞类似，但有不规则细胞核及糖原颗粒减少的现象，可能与肝细胞传代过程中发生了部分变异有关，详细机制尚需进一步研究.
　　参考文献:
　　
　　［1］Li YQ，Zhao DH，Pan BR，Li BG，Sun WJ，Tian Q，Jia M.Ef-fect of gentiopicroside on liver injury of rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（18）:1645-1649.
　　［2］Liu L，Li BL，Zhou SY，Mei QB，Zhao DH.Effects of tangufi-can maxim polysaccharides in acute liver injury of mice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（6）:549-551.
　　［3］Yuan WQ，Wang H，Lu ZR.Differential regulation of sodium pumpα-subnit isoform gene by ouabain and digoxin in rat liver ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（16）:1451-1455.
　　［4］Guo XG，Miao JY，Wang ZY.Protective effect of L-NAME on chronic liver induced by CCl4in rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（22）:2061-2063.
　　［5］Zhang M，Shu YJ，Chen B，Tang CW.Morphological observa-tion of long-term primarily cultured rat hepatocytes ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1995;16（6）:418-422.
　　［6］Jarnagin WR，Rockey DC，Koteliansky VE，Wang SS，Bissell DM.Expression of variant fibronectins in wound healing:Cellu-lar source and biological activity of the EⅢA segment in rat he-patic fibrogenesis ［J］.Cell Biol，1994;127:2037-2048.
　　［7］George J，Wang SS，Sevcsik AM，Sanicola M，Cate RL，Koteliansky VE，Bissell DM.Transforming growth factor-βini-tiates wound repair in rat liver through induction of the EⅢA fi-bronectin splice isoform ［J］.Am J Pathol，2000;156:115-124.
　　［8］Serini G，Bochaton-Piallat ML，Ropraz P，Geinoz A，Borsi L，Zardi L，Gabbiani G.The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-β1［J］.Cell Biol，1998;142:873-881.
　　［9］Watannabe K，Takahashi H，Habu Y，Kamiya-Kubushro N，Kamiya S，Nakamura H，Yajima F.Interaction with heparin and matrix metalloproteinase2cleavage expose a cryptic anti-adhe-sive site of fibronectin ［J］.Biochemistry，2000;39:7138-7144.
　　［10］Arthur MJP.FibrogenesisⅡ.Metalloproteinases and their in-hibitors in liver fibrosis ［J］.Am J Physiol Gastrointest liver Physiol，2000;279:245-249.
　　［11］Fukai F，Kamiya S，Ohwaki T，Goto S，Akiyama K，Goto T，Katayama T.The fibronectin-derived anti-adhensive peptideⅢ14-2suppressess adhension and apoptosis of leukemic cell lines through down-regulation of protein-tyrosine phosphorylation ［J］.Cell Mol Biol，2000;46:145-152.
　　［12］Iwamoto H，Sakai H，Katoh K，Nakamuta M，Nawata H.Solu-ble Arg-Gly-Asp peptides reduce collagen accumulation in cul-tured rat hepatic stellate cells ［J］.Dig Dis Sci，1999;44:1038-1045.转贴于