作者：李郁 陈志南 邢金良 郭小楠 黄宝成
【关键词】 肝肿瘤
关键词: 肝肿瘤;遗传载体;RNA，反义;HAb18G/CD147
摘 要:目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体. 方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI-neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI-asHAb18G.用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实:转染细胞HHCC/asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC/neu及HHCC均为强阳性. 结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G.为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础.
Keywords:liver neoplasms;genetic vectors;RNA，anti-sense;HAb18G/CD147
Abstract:AIM To construct eukaryotic vector expressing antisense RNA of HAb18G.METHODS PCI-asHAb18G was constructed by inserting HAb18G cDNA reversely to eu-karyotic expression vector PCI-neo.The hepatoma cell strain HHCC was transfected by PCI-asHAb18G.After selected by G418，positive clones were identified by fluorocytometry as-say and indirect immunofluorescence staining.RESULTS It was verified that construction of the eukaryotic antisense RNA expression vector PCI-asHAb18G was correct by partial nucleotide sequencing and restriction endonuclease digestion.Indirect immunofluorescence staining and fluorocytometric assay show that the expression of HAb18G was negtive in HHCC transfected by PCI-asHAb18G and its expression was positive in HHCC transfected by PCI-neo and untransfected HHCC.CONCLUSION These results lay the foundation for further study of the biological functions of HAb18G/CD147and gene therapy for hepatoma.
0 引言
HAb18是我室用肝癌抗原免疫小鼠得到的特异性单克隆抗体（mAb）［1］ ，该mAb药物已进入Ⅱ期临床［2］ .我们构建了人肝癌组织cDNA文库［3］ 并用HAb18mAb从其中筛选得到其相应抗原HAb18G，查询Genebank发现其基因序列与CD147分子序列一致.CD147分子，又名EMMPrin（细胞外基质金属蛋白酶诱导因子），最初源于人肺癌细胞系LX-1，在肝癌组织中发现尚属首次，它具有刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶（MMPs）的功能［4］ .MMPs能降解细胞外基质因而在肿瘤的侵袭和转移中起到重要的作用［5］ .为研究HAb18G与肝癌转移的关系，我们构建HAb18G反义RNA真核表达质粒，并观察其对人肝癌细胞HAb18G的表达的抑制作用.
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pBluescript ks（+）/HAb18G由本室构建，内含HAb18G的全长cDNA编码序列;PCI-neo真核表达质粒购自Promega公司;宿主菌大肠杆菌JM109及肝癌细胞株HHCC由本室常规保存;Lipfectinamine2000 脂质体转染试剂盒购自Gibco公司，质粒提取试剂盒、G418购自Promega公司，限制性内切酶，T4连接酶购自宝泰克公司;凝胶纯化试剂盒购自Clontech公司;抗人肝癌的鼠单克隆抗体HAb18由本室制备;免疫组化SP染色试剂盒购自福州迈新公司.
1.2 方法
1.2.1 DNA操作与克隆 DNA操作包括感受态菌株的制备，质粒的扩增、提取，限制性酶切，琼脂糖凝胶电泳分离均参照文献［6］进行，PCI-neo及pBlue-script ks（+）/HAb18G质粒分别经XbaⅠ及XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，以凝胶纯化试剂盒纯化相应的DNA片段.用T4噬菌体DNA连接酶将1.7kb左右HAb18G cDNA全长序列反向连接到PCI-neo真核表达质粒的XhoⅠ-XbaⅠ间，构建成PCI-asHAb18G反义RNA表达载体，转化感受态细菌JM109，随机挑选氨苄抗性的转化克隆，限制性内切酶酶切鉴定.
1.2.2 插入片段部分序列的分析 以T3 启动子序列为测序引物，直接以构建的PCI-asHAb18G反义RNA表达载体为模板，用全自动荧光DNA序列分析仪进行单向DNA序列分析.
1.2.3 反义RNA抑制HAb18G表达 用阳离子脂质体Lipfectinamine2000 介导将空质粒表载体PCI-neo及重组质粒PCI-asHAb18G转染至人肝癌细胞HHCC，分别命名为HHCC/neo和HHCC/asHAb18G，并以HHCC作为阴性对照.具体操作步骤参照说明书及文献［7］进行.转染第2日将细胞以1∶6的稀释比例传代培养，2d后用含400mg・LG418的选择培养液连续培养4wk，每周换液2次，用有限稀释法挑选单个抗性细胞在G418（100mg・L-1 ）下常规培养扩增.
1.2.4 转染细胞的免疫组织化学染色 取经转染的细胞爬片，经冷丙酮固定，进行SP（链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶）法染色，（具体操作步骤参照说明书），以抗HAb18G的mAbHAb18为一抗，生物素标记的羊抗鼠Fc段特异性IgGmAb为二抗，与链霉素抗生物素蛋白―过氧化酶及作用底物（DAB）混合进行间接免疫组织化学染色，显微镜下观察结果并照相.以空载体转染的细胞设立对照.
1.2.5 转染细胞的流式细胞仪分析 收集转染后G418筛选获得的HHCC细胞单个克隆进行间接免疫荧光染色.将1×105 细胞吹打成单细胞悬液，加入一抗HAb18及荧光素标记的二抗，固定，用流式细胞仪检测分析.
2 结果
2.1 HAb18G反义RNA表达 质粒的构建及酶切鉴定HAb18G反义载体经XhoⅠ和XbaⅠ酶切后得到1.7kb左右人HAb18GcDNA及5.5kb左右两 个片段.用SmaⅠ酶切（质粒多克隆酶切位点及HAb18GcDNA1.1kb左右各有一酶切位点）得到两个片段，大小分别为1.1kb左右及6.1kb（Fig1）.酶切结果证明载体构建成功，经测序更进一步得以证实（Fig2），将其命名为PCI-asHAb18G.
图1 － 图2 略
2.2 免疫组化染色 结果显示HHCC反义转染株HHCC/asHAb18G为阴性染色（Fig3），而HHCC空载体转染株HHCC/neo与HHCC均为强阳性染色（Fig4）.
2.3 流式细胞仪结果 反义载体转染株HHCC/asHAb18G细胞荧光强度低，平均荧光强度为5，HHCC空载体转染株HHCC/neo与HHCC大体相同，平均荧光强度为500（Fig5）.
CD147分子是广泛表达于造血及非造血细胞系，Mr5000-6000的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族（IgSF）成员.编码CD147的基因定位于人19号染色体19p13.3，人CD147分子曾有多种不同的命名，包括TCSF/EMMPrin，M6，Basigin，Neurothe-lin.如此多的命名也反映其在不同的组织中有不同的功能.在人肝癌组织中发现CD147分子，目前尚无报道，因此其在肝癌组织的功能也值得去研究.我们曾经用表达HAb18G（CD147）的CHO细胞刺激人成纤维细胞，证实成纤维细胞分泌MMPs的量大大增加［8］ ，即其具有EMMPrin的功能.EMMPrin最初源于人肺癌细胞系LX-1，属免疫球蛋白超家族（IgSF）成员，能够结合于内皮细胞及纤维母细胞［9］ ，因纯化的该蛋白可刺激人成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）而得名.
图3 － 图5 略
恶性肿瘤的转移虽然极其复杂，但在其侵袭、转移演进过程中，癌细胞必须首先具备降解细胞外结缔组织间质和血管基底膜这些天然屏障的能力，这依赖于蛋白水解酶的作用.蛋白水解酶主要包括4类，即:丝氨酸蛋白酶（如纤溶酶原激活物PAs）、半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B）以及天门冬氨酸蛋白酶（如胃蛋白酶）和基质金属蛋白酶MMPs，其中基质金属蛋白酶最为重要.大量研究已表明，恶性肿瘤组织中MMPs的含量及活性显著高于其周围正常组织，且与肿瘤恶性表型密切正相关［10］ ，因而是肿瘤具备高转移潜能的一个客观、良好的分子指标，已逐渐成为近年来肿瘤侵袭、转移研究的热点.MMPs在肿瘤转移中的作用可概括为:①破坏局部组织结构，促进肿瘤生长;②破坏基底膜屏障，利于肿瘤转移;③通过对细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管的形成.为此，我们构建了HAb18G反义RNA质粒，用反义RNA特异封闭肿瘤细胞的mRNA，封闭肝癌细胞表面HAb18G/CD147的表达，从而抑制人成纤维细胞分泌MMPs，进而抑制肝癌细胞的侵袭.实验结果表明，当PCI-asHAb18G转染肝癌细胞后，转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，流式细胞仪证实其膜表面荧光强度减弱.这些变化主要是由于反义RNA与HAb18GmRNA结合，阻碍了其翻译过程，封闭了HAb18G分子的表达.上述结果提示，用HAb18G反义RNA阻断其表达，有可能降低其刺激成纤维细胞产生MMPs的能力，进而可以抑制肝癌细胞的侵袭能力，改变肿瘤细胞的生物学行为.合理地利用反义技术以改变和抑制肿瘤细胞的恶性行为，是肿瘤基因治疗的一个方向.
参考文献:
［1］Qui K，Chen ZN，Liu ZG.Manufacture of human hepatoma an- tibody F（ab’）2and single fragment of Fab by pawpaw proteinase ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1995;16（2）:116-117.
［2］Lou C，Bian HJ，Chen ZN.Pharmacokinetics of radioim-munotherapeutic agent of 188 Re-HAb18F（ab’）2in hepatoma-bearing nude mice ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:214-216.
［3］Huang BC，Chen ZN，Xue LQ，Jiang SC.Construction of iden-tification of human hepatoma cell cDNA library ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:138-140.
［4］Decastro R，Zhang Y，Guo H，Kataoka H，Gordon MK，Toole Bp，Biswas G.Human keratinocytes express EMMPRIN，an extracellular matrix metalloproteinase inducer ［J］.J InvestDer-matol，1996;106（6）:1260-1265.
［5］Rooprai HK，Mccormick D.Proteases and their inhibitors in hu-man brain tumours:A review ［J］.Anticancer Res，1997;17（6B）:4151-4162.
［6］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Fenzi Kelong Shiyan Zhi-nan（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）［M］，2nd ed，Beijing:Kexue Chubanshe（Science Press），1996:787-788.
［7］Hu ZY，Xing GC，He FC.Optimizing of transfecting COS-7cells by liposome ［J］.Bull Acad Mil Med Sci，1997;21（2）:125.
［8］Wang XH，Chen ZN，Guo XN.Correlation between CD147molecular and expression of MMPs in hepatoma cell lines ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:217-219.
［9］Kasinrerk W，Tokrasinwit N，Phunpae P.CD147monoclonal antibodies induce homotypic cell aggregation of monocytic cell line U937via LFA-1/ICAM-1pathway ［J］.Immunology，1999;96（2）:184-192.
［10］Guo XN，Chen ZN.Human hepatoma membrane-associated antigen HAb18G is indentified with CD147molecule ［J］.Zhongliu Fangzhi Yanjiu（Cancer Res Prev Treat），2000;27（1）:7-10.