关于异氟醚预处理脑保护作用的剂量-效应关系

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　　　　 作者：吴明春 熊利泽 朱正华 侯立朝 郑 玉 桑韩飞

【关键词】 异氟醚
　　关键词: 异氟醚;预处理;脑缺血;剂量效应
　　摘 要:目的 研究异氟醚预处理脑保护作用的剂量效应关系. 方法 40只雄性SD大鼠，随机分为4组:对照组，Iso1，Iso2和Iso3组（n=10）.对照组大鼠每日吸4L min-1 （970mL L-1 O2 ）O2 1h，连续5d.Iso1，Iso2和Iso3组大鼠分别接受浓度为7.5，15.0和22.5mL L-1 的异氟醚预处理（异氟醚和4L min-1 O2 ），每日1h，连续5d.最后1次处理结束24h后，用右侧颈内动脉尼龙线线栓法制作大脑中动脉阻闭（mid-dle cerebral artery occlusion，MCAO）模型.异氟醚预处理效果根据再灌注24h时的神经损害评分及脑梗死容积判定. 结果 Iso2和Iso3组大鼠神经功能障碍及脑梗死容积均与对照组及Iso1组相比差异显著（P&<0.05）.Iso3组大鼠神经功能障碍及脑梗死容积与Iso2组相比差异显著（P&<0.05）. 结论 异氟醚预处理需达到一定浓度才能诱导脑缺血耐受，并存在一定的剂量效应关系.
　　
　　Keywords:isoflurane;preconditioning;cerebral ischemia;dose-response
　　
　　Abstract:AIM To study the dose-response effects of isoflu-rane preconditioning to induce ischemic tolerance in transient middle cerebral artery occlusion model in rats.METHODS Forty male SD rats were randomly assigned to4groups:the control group，Iso1group，Iso2group and Iso3group，with10in each group.The animals in the control group received4L min-1 O2 1h everyday for5d.The animals in the last three groups received7.5，15.0and22.5mL L-1 isoflurane in4L min-1 O2 1h everyday for5d respectively.24h after the last treatment，transient MCAO was induced by introduc-ing a3-nylon monofilament suture through right internal carotid artery.Neurologic deficit scores and infarct volume were used to assess the effects of isoflurane preconditioning.RESULTS The neurologic deficit scores and infarct volumes in the Iso2group and Iso3group were smaller than those of the control group and Iso1group（P&<0.05）.The neurologic deficit scores and infarct volume in the Iso3group were smaller than that of the Iso2group（P&<0.05）.CONCLUSION Isoflurane preconditioning induces ischemic tolerance in a dose-response manner，and a dose threshold is needed to induce protective effects against focal cerebral is-chemic damage.
　　
　　0 引言
　　
　　1990年Kitagawa等［1］ 在沙土鼠前脑缺血模型中发现缺血预处理可诱导脑缺血耐受，对随后的脑缺血损伤产生保护作用，从而为治疗脑缺血损伤研究提供了一种新的思路.随后研究发现，许多药物，如TNF-a，IL-1和LPS［2-4］ ，可模拟缺血预处理，诱导脑缺血耐受.但由于这些物质本身的毒副作用，其临床用途受到很大限制.最近有研究表明异氟醚预处理可诱导心肌缺血耐受，产生缺血预处理效应［5-7］ .我们的初步研究发现，异氟醚预处理对随后大鼠短暂性大脑中动脉阻闭模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）引起的脑缺血损伤也有明显的保护作用［8］ ，但异氟醚预处理是否存在剂量效应关系尚不清楚.我们拟利用大鼠局灶性脑缺血模型，研究异氟醚预处理的剂量效应关系，为今后进一步实验及可能临床应用提供实验基础.
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 40只雄性SD大鼠，体质量300～350g（由第四军医大学实验动物中心提供），随机分为4组:对照组，Iso1，Iso2和Iso3组（n=10）.对照组大鼠每日吸970mL L-1 O2 1h，连续5d.Iso1，Iso2和Iso3组大鼠分别接受浓度为7.5，15.0和22.5mL L-1 的异氟醚预处理（异氟醚和4L min-1 氧），每日1h，连续5d.
　　1.2 方法
　　 　
　　1.2.1 局灶性脑缺血模型 在最后1次预处理结束24h后，动物用40mL L-1 异氟醚诱导麻醉，然后用20mL L-1 异氟醚吸入维持麻醉深度，保留自主呼吸.大脑中动脉阻闭（MCAO）模型采用右侧颈内动脉尼龙线线栓法，参考Longa等［9］ 的改良方法.动物麻醉后取经颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉.结扎颈总动脉及颈外动脉后，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线（3-0，ETHICON，Japan）置入颈内动脉约17.5mm，有轻微阻力感时停止，结扎颈内动脉，缝合切口.麻醉苏醒后，将动物放入鼠笼.阻闭120min后再次麻醉，打开切口，抽出尼龙线，恢复再灌注.术中体温用肛温探头连接多功能监测仪（Spacelab，USA）监测，并用烤灯维持在37.0～37.5℃.
　　
　　1.2.2 动物恢复及神经损害评分 麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食.脑缺血再灌注后24h，由一不了解分组情况的观察者评估记录神经损害评分，方法参考Longa等［9］ 的报道，即由6级评分法:0级，无功能障碍;1级，不能伸展左侧前肢;2级，向左侧旋转;3级，向左侧倾倒;4级，无自主活动伴意识障碍;5级，死亡.
　　
　　1.2.3 脑梗死灶测量 再灌注24h后，神经损害评分完成后，动物用40mL L-1 异氟醚深度麻醉后处死，迅速取出鼠脑，置于冰盐水10min，按冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入20g L-1 TTC溶液（37℃）中染色30min，然后用100g L-1 甲醛缓冲液固定.固定24h后用数码相机（KODAK，DC240，USA）拍照，输入计算机，用图像处理软件（ADOBE，PHOTOSHOP5.0）计算梗死面积（粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区）.各脑片梗死面积之和乘以厚度（2mm）作为脑梗死容积.
　　统计学处理:所有参数用x ±s表示，用SPSS软件进行分析.其中脑梗死容积用单因素方差分析（ANOVA）统计，神经行为学评分用Kruskal-Wallis方法检验.P&<0.05表示统计学差异明显.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 神经损害评分 再灌注24h后神经损害评分:Iso2和Iso3组大鼠神经损害与对照组及Iso1组相比 差异显著（P&<0.05）.Iso3组大鼠神经损害与Iso2组相比差异显著（P&<0.05，Tab1）.
　　
　　表1 再灌注24h神经损害评分　略
　　
　　图1 略
　　
　　3 讨论
　　
　　自1990年Kitagawa等［1］ 首次报道了脑缺血耐受现象以来，缺血预处理对脑缺血损伤的保护作用已有大量文献报道.脑缺血耐受现象的发现，开辟了脑保护研究的新途径.由于缺血预处理诱导脑缺血耐受需要中断脑血供，加上其方案、保护时限和发生机制尚未完全清楚，很难在临床推广运用.药物预处理具有相对安全、方便、易于剂量控制等优点，在脑血管疾病的防治方面可能发生积极作用，成为近年关注的热点.人们希望借助脑缺血预处理的概念，继续寻找能被临床接受和应用的化学预处理方法，并研究其机制，最终获得安全有效的脑保护药物或措施.
　　
　　最近研究表明吸入麻醉药，具有类似于缺血预处理的效应，对心肌缺血再灌注损伤有较强的保护作用，能明显降低心肌梗死面积［5，6］ .目前，吸入麻醉药预处理也已用于有心肌梗死危险的心脏或非心脏手术冠心病患者，以减少心肌梗死面积，减少心功能紊乱，改善心脏灌注［10，11］ .我们的初步研究发现［8］ ，异氟醚预处理（20mL L-1 异氟醚和4L min-1 O2 ），每日1h，连续5d对随后大鼠短暂性MCAO引起的脑缺血损伤有明显的保护作用:异氟醚组神经功能障碍及脑梗死容积与空白对照组及吸氧对照组相比差异显著（P&<0.05）.在随后研究中我们比较了同一浓度不同日数下异氟醚预处理效果，发现3，5和7d组神经功能障碍及脑梗死容积与吸氧对照组相比差异显著（P&<0.05），1d组与吸氧对照组无统计学差别（P&>0.05）.

本研究选择7.5，15.0和22.5mL L-1 的异氟醚（异氟醚和4L min-1 O2 ）行预处理，再灌注24h后的脑梗死容积及行为学评分结果，15.0mL L-1 组和22.5mL L-1 组与对照组及7.5mL L-1 组相比差异显著（P&<0.05），22.5mL L-1 组与15.0mL L-1 组相比差异显著（P&<0.05）.结果表明异氟醚预处理诱导脑缺血耐受时需要达到一定浓度阈值，并在一定浓度范围内存在剂量-效应关系.在本实验中，我们仅观察了浓度分别为7.5mL L-1 （0.5mini-mal alveolar concentration，MAC），15.0mL L-1 （1MAC），22.5mL L-1 （1.5MAC）的异氟醚预处理效果，是因为大鼠吸入高浓度的异氟醚时会发生呼吸抑制，有引起缺氧预处理的可能.
　　
　　目前研究表明，K+ ATP 通道在缺血预处理的保护作用中起着很重要的作用，通过药物激活这些通道，可产生类似于缺血预处理的效应［12，13］ .吸入麻醉药通过激活K+ ATP 通道［5，6］ ，对随后的心肌缺血损伤起保护作用.我们推测异氟醚预处理也通过激活K+ ATP 通道诱导脑缺血耐受;不同浓度的异氟醚对K+ ATP 通道的敏感性不同，因而异氟醚预处理存在剂量-效应关系.吸入麻醉药预处理还能保证血管内皮系统的功能完整性，有利于维持血管的舒张能力［14］ .吸入麻醉药预处理后出现的血管内皮功能改善可能是由于内皮细胞内的Ca2+ 负荷降低所致，被认为与NO的补充有关［15］ .
　　
　　异氟醚预处理的机制尚不完全清楚，需要进一步实验研究.异氟醚作为临床上广泛使用的吸入麻醉药之一，因其毒副作用小，其预处理效应有重要临床意义，为今后在解决一些神经外科手术中预料会发生短暂性术中缺血时提供了一种新的可能途径.随着对其预处理机制的进一步研究，必将对缺血性脑损伤的治疗产生深远影响.
　　参考文献:
　　
　　［1］Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，Hata R，Ueda H，Ni-inobe M，Handa N，Fukunaga R，Kimura K，Mikoshiba K.’Ischemic tolerance’phenomenon found in the brain ［J］.Brain Res，1990;528（1）:21-24.
　　［2］Nawashiro H，Tasaki K，Ruetzler CA，Hallenbeck JM.TNF-alpha pretreatment induces protective effects against focal cere-bral ischemia in mice ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1997;17（5）:483-490.
　　［3］Ohtsuki T，Ruetzler CA，Tasaki K，Hallenbeck JM.Inter-leukin-1mediates induction of tolerance to global ischemia in gerbil hippocampal CA1neurons ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1996:16（6）:1137-1142.
　　［4］Tasaki K，Ruetzler CA，Ohtsuki T，Martin D，Nawashiro H，Hallenbeck JM.Lipopolysaccharide pre-treatment induces resis-tance against subsequent focal cerebral ischemic damage in spon-taneously hypertensive rats ［J］.Brain Res，1997;748（1-2）:267-270.
　　［5］Kersten JR，Schmeling TJ，Pagel PS，Gross GJ，Warltier DC.Isoflurane mimics ischemic precondition ing via activation of K（ATP）channels:Reduction of myocardial infarct size with an a-cute memory phase ［J］.Anesthesiology，1997;87（2）:361-370.
　　［6］Cason BA，Gamperl AK，Slocum RE，Hickey RF.Anesthetic-induced preconditioning:Pre-vious administration of isoflurane decreases myocardial infarct size in rabbits ［J］.Anesthesiology，1997;87（5）:1182-1190.
　　［7］Roscoe AK，Christensen JD，Lynch C3rd.Isoflurane，but not halothane，induces protection of human myocardium via adeno-sine A1receptors and adenosine triphosphate-ensitive potassium channels ［J］.Anesthesiology，2000;92（6）:1692-1701.
　　［8］Zhu ZH，Xiong LZ，Dong HL，Hu WN，Hou LC.Isoflurane preconditioning induces ischemic tolerance in MCAO rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（5）:474-476.
　　［9］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，Cummins R.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］.Stroke，1989;20（1）:84-91.
　　［10］Tomai F，De Paulis R，Penta de Peppo A，Colagrande L，Caprara E，Polisca P，De Matteis G，Ghini AS，Forlani S，Colella D，Chiariello L.Beneficial impact of isoflurane during coronary bypass surgery on troponin I release ［J］.G Ital Cardi-ol，1999;29（9）:1007-1014.
　　［11］Belhomme D，Peynet J，Louzy M，Launay JM，Kitakaze M，Menasche P.Evidence for preconditioning by isoflurane in coro-nary artery bypass graft surgery ［J］.Circulation，1999;100（19）:340-344.
　　［12］Day YJ，Gao Z，Tan PC，Linden J.ATP sensitive potassium channel and myocardial preconditioning ［J］.Acta Anaesthesiol Sin，1999;37（3）:121-131.
　　［13］Downey JM，Cohen MV.Do mitochondrial K（ATP）channels serve as triggers rather than end-effectors of ischemic preconditioning’s protection ［J］?Basic Res Cardiol，2000;95（4）:272-274.
　　［14］Novalija E，Fujita S，Kampine JP，Stowe DF.Sevoflurane mim-ics ischemic preconditioning effects on coronary flow and nitric oxide release in isolated hearts ［J］.Anesthesiology，1999;91（3）:701-712.
　　［15］Xi L，Kukreja RC.Pivotal role of nitric oxide in delayed phar-macological preconditioning against myocardial infarction ［J］.Toxicology，2000;155（1-3）:37-44.