关于桥本甲状腺炎中Bcl┐2和Bax与PCNA关系的免疫组化双标法

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　　　　　　 作者：姬秋和　宋民喜　张雅萍　张南雁　马福成　杨守京

【关键词】 桥本甲状腺炎
　　关键词: 桥本甲状腺炎;细胞凋亡;增殖;增殖细胞核抗原
　　摘 要:目的 观察Bcl-2和Bax与PCNA在桥本甲状腺炎（HT）中表达及分布的关系. 方法 以16例毒性甲状腺肿（NTG）为对照，采用TUNEL及免疫组织化学双标记法分别检测16例HT患者甲状腺标本中的细胞凋亡水平及PCNA与Bcl-2和Bax的分布. 结果 凋亡率（AR）在HT组为（34.0±14.7）%，NTG组为（0.9±0.6）%;增殖率（PR）分别为（8.5±3.6）%，（4.2±2.4）%;AR/PR比值各为4.5±2.4和0.5±0.9.显示AR，PR及AR/PR比值在HT组均显著高于NTG组（P&<0.01）.在HT中，Bcl-2，Bax免疫染色阳性率分别为88%和82%;共表达细胞占Bcl-2或Bax阳性细胞的比例各为33%和16%. 结论 HT中甲状腺滤泡细胞凋亡与增殖活动均活跃，凋亡水平增高更为显著;浸润淋巴细胞增殖活跃，凋亡少见.部分甲状腺滤泡细胞PCNA与Bcl-2或Bax共表达.其凋亡和增殖的失平衡可能与调节蛋白Bcl-2或Bax的作用有关，也可能是HT病理改变的主要机制之一.
　　
　　Abstract:AIM To investigate relationship between the expression and distribution of PCNA and those of Bcl-2or Bax in Hashimoto’s thyroiditis（HT）.METHODS Specimen from nontoxic goiter（NTG，n=16）were used as the con-trol.Apoptotic level and expressions as well as distributions of PCNA，Bcl-2and Bax in thyroid tissues from16HT pa-tients were detected by TUNEL and immunohistochemical double labelled staining repectively.RESULTS Apoptotic rates（AR）in the HT and NTG groups were（34.0±14.7）%and（0.9±0.6）%respectively，while the prolifertive rates（PR）were（8.5±3.6）%and（4.2±2.4）%，and AR/PR ra-tios in HT and NTG were4.5±2.4，0.5±0.9respectively，which indicated that AR，PR，AR/PR ratio in HT were sig-nificantly higher than those in NTG（P&<0.01）.The rates of positive immunostaining for Bcl-2and Bax on part of thyro-cytes from HT were88%and82%，and Bcl-2or Bax positive percentages of co-expression thyrocytes were33%and16%.CONCLUSION Both apoptotic and proliferative activities in thyrocytes of HT group were active，especially apoptotic lev-el，and there was a high proliferative activity in infiltrating lymphoid cells where apoptosis is rarely seen.There was co-expression of PCNA with Bcl-2or Bax on part of thyrocytes in HT.And both Bcl-2and Bax might regulate the imbalance between apoptosis and proliferation which may be the major mechanisms of pathologic changes in the HT group.
　　
　　0 引言
　　
　　桥本甲状腺炎（HT）以甲状腺滤泡破坏，大量淋巴细胞浸润为主要病理改变.近年来，多数认为细胞凋亡在其发病机制中起重要作用.我们前期实验［1］ 显示:HT甲状腺标本中甲状腺上皮细胞Fas/FasL阳性细胞部分呈代谢旺盛状态.但HT时甲状腺细胞增殖特征如何，凋亡与增殖有无关联，值得研究.增殖细胞核抗原（PCNA）是一种和细胞增殖有关的核蛋白，为观察细胞增殖的良好指标［2］ .Bcl-2，Bax属于Bcl-2家族的分别抑制和促进凋亡的功能相反的蛋白质.我们以PCNA，Bcl-2和Bax为指标，采用免疫组织化学双标记及TUNEL法探讨HT时甲状腺细胞的细胞凋亡与增殖有无关联.
　　
　　1 对象和方法
　　
　　1.1 对象 1989/1999在西京医院普外科活检及手术的甲状腺标本，经病理诊断HT16（男1，女15）例，年龄26～59（平均42）岁;毒性甲状腺肿（NTG）16（男1，女15）例，年龄26～58（平均43）岁.入选患者均未经药物治疗.标本经40g・L-1 多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成3μm连续切片.
　　
　　1.2 方法 原位细胞凋亡检测试剂盒（碱性磷酸酶）购自德国宝灵曼公司.TUNEL法:切片脱蜡至水→PK处理，37℃20min→PBS，2min×3→加TUNEL反应混合液，37℃2h→PBS，5min×3→加convert-AP，37℃1h→PBS，5min×3→bufferⅠ，5min×1→bufferⅢ，5min×1→BCIP/NBT显色，核固红衬染→封片观察.TUNEL阳性率代表凋亡率（AR）.免疫组化双标记:采用微波抗原修复免疫组化双标记En VisionTM二步法（Dako公司），按说明操作.第一标记PCNA（PC-10）为鼠抗人mAb（福州迈新生物技术有限公司），第二标记Bcl-2和Bax（为兔抗人多克隆抗体）以及标记液（SABC-AP）均购自武汉博士德生物工程有限公司.第二抗体鼠抗兔IgG及羊抗兔IgG均购自Sigma公司.以正常鼠及兔血清代替相应一抗作阴性对照.选取我们前期实验的HT标本（包括甲状腺上皮细胞及淋巴滤泡）及结肠癌作阳性对照.第一标记DAB显色，第二标记用SABC-AP标记，NBT/BCIP显色，未衬染.
　　
　　1.3 实验处理 由2个独立观察者用10倍物镜对每个标本随机选取10个视野，求得凋亡和增殖阳性核占每一视野中总甲状腺滤泡细胞数的百分率.Bcl-2和Bax免疫组化结果判定:免疫染色阴性的标本为“-”;免疫染色阳性细胞较少，且散在分布者为“+”;免疫染色阳性细胞较多，分布密集者为“”.求出每组中“+”和“”标本所占总例数的百分比为该组标本阳性率.
　　
　　统计学处理:采用SAS软件对HT和NTG两组的细胞凋亡率（AR）、增殖率（PR）及AR/PR进行t检验和χ2 分析;对Bcl-2，Bax免疫染色的标本阳性率进行Fisher精确概率检验.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 凋亡细胞的检测 TUNEL法染色阳性的物质位于胞核，呈紫蓝色颗粒.HT和NTG两组的AR分别为（34.0±14.7）%和（0.9±0.6）%（Tab1），有显著差异（P&<0.01，Tab1）.NTG中凋亡细胞呈散 在分布.HT中凋亡细胞多位于淋巴细胞附近的甲状腺滤泡，呈簇状出现，凋亡的淋巴细胞少见.
　　
　　表1 桥本甲状腺炎中细胞凋亡及增殖率　略
　　
　　2.2 免疫组化双标记染色 HT和NTG两组的PR分别为（8.5±3.6）%和（4.2±2.4）%，HT组显著高于NTG组（P&<0.01，Tab1）.
　　
　　2.2.1 PCNA的表达及分布 PCNA免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，位于胞核.在NTG中多位于小甲状腺滤泡，染色浅，阳性细胞呈立方状，少数扁平状.HT中PCNA阳性细胞分布广泛，免疫染色增强，在Bcl-2或Bax不表达的甲状腺滤泡中亦有表达.在浸润淋巴细胞和生发中心的区域分布密集（Fig1）.PCNA染色阳性细胞呈方立状或椭圆状，少数呈扁平状，其免疫染色强弱不等.
　　
　　2.2.2 Bcl-2的表达及分布 Bcl-2免疫染色阳性物质呈紫蓝色颗粒，位于胞质及胞膜.NTG组Bcl-2染色较弱，阳性细胞较少（Tab2）.HT组Bcl-2免疫染色增强，分布不均匀.主要位于远离淋巴细胞的甲状腺滤泡，亦见同一滤泡远离淋巴滤泡一侧显色较近侧增强.淋巴滤泡生发中心区域Bcl-2染色弱或无（Fig2）.而未形成生发中心的淋巴细胞附近的甲状腺滤泡Bcl-2染色增强，阳性细胞增加.HT中共表达细胞占Bcl-2阳性细胞比例为33%.
　　
　　表2 Bcl-2，Bax在桥本甲状腺炎及毒性甲状腺肿中的表达　略
　　
　　2.2.3 Bax的表达及分布 Bax免疫染色呈紫蓝色颗粒，位于胞质及胞膜.NTG组Bax免疫染色阳性细胞较少（Tab2）.HT组Bax免疫染色增强，分布不均匀，与Bcl-2相反，其强阳性细胞多位于淋巴滤泡附近的甲状腺滤泡，远离者染色浅，亦可见到靠近淋巴滤泡附近的同一个完整的甲状腺滤泡，远离一侧者染色较对侧强，都可见到共表达细胞（Fig1），并占Bax阳性细胞的比例为16%.
　　
　　图1 － 图2 略
　　
　　3 讨论
　　
　　Tamura等［3］ 发现，正常鼠的甲状腺组织PCNA与TUNEL阳性细胞有一定的比例（0.46），凋亡和增殖间有一定的平衡关系.Okayasu等［4］ 报道，HT中甲状腺细胞凋亡、增殖活动均增加.我们的实验TUNEL显示:HT中凋亡水平（AR）显著升高（P&<0.01）.HT中TUNEL阳性甲状腺滤泡细胞多位于浸润淋巴细胞附近，呈簇存在，而远离该区域凋亡核 少见，凋亡的淋巴细胞少见.免疫组织化学染色:HT组中AR，PR，AR/PR比值以及Bcl-2，Bax免疫染色阳性率均显著高于NTG组.提示HT中凋亡、增殖活动均有增加，但以凋亡水平升高为主.部分HT患者临床表现为甲状腺功能减退，可能正是由于细胞凋亡远多于增殖，二者比例失调导致甲状腺滤泡逐渐萎缩、破坏.
　　HT中PCNA阳性的淋巴细胞密集分布，TUNEL阳性淋巴细胞少见，提示其增殖活跃，凋亡减少.可能与TCR/CD3和共刺激信号CD28/B7.1或B7.2交联存在，刺激细胞因子产生并启动增殖［5，6］ 有关.已经证实，自身免疫性甲状腺炎模型BB/W鼠的甲状腺中有TNF-α，IFN-γ和IL-2等基因表达［7］ .IL-2与其受体结合，驱使T细胞从G1期进入S，M期，从而生成大量T细胞.Giordano等［8］ 认为，HT中淋巴细胞Bcl-2的高表达，也可造成淋巴细胞浸润.但我们前期［9］ 及本次实验均发现，淋巴滤泡Bcl-2免疫染色阴性，此与报道不一致.可能与未能捕捉到不同成熟期淋巴滤泡的现象有关.是否与标本选择、抗体制备及免疫功能紊乱的程度有关，目前尚无定论.

　　本实验HT中，甲状腺细胞Bcl-2免疫染色增强，强阳性的细胞远离浸润淋巴滤泡区域，少量位于其附近.Bax与其分布相反，Bax强阳性甲状腺细胞多位于浸润淋巴滤泡附近.Bcl-2和Bax在HT甲状腺滤泡细胞中的特征性分布，与我们前期实验结果一致［9］ .这种分布与细胞凋亡密切相关.Bcl-2和Bax的比例可决定其凋亡与存活［10］ .近年来，人们认为，Bcl-2对凋亡的调控主要通过对线粒体调控来实现.Bcl-2定位于线粒体膜内外侧，可抑制Bax放大了的Fas凋亡级联［11］ .Nomura等［12］ 报道，Bcl-2抑制凋亡部分原因归于抑制Bax由胞质转运定位于线粒体膜，它通过矫正某些凋亡期间涉及Bax转运、定位的胞质因子来实现.而Bax可调解渗透性转运孔（PTP）开启，导致细胞色素C释放，完成Caspase3，7的加工.那么，HT中浸润淋巴滤泡附近的甲状腺细胞Bcl-2表达下调，Bax高表达，造成Bcl-2/Bax比例下调，Bcl-2-Bax杂二聚体增多，对Fas介导凋亡信号敏感性增强，PTP开启，细胞色素C释放，Caspase酶系加工活化，凋亡级联扩大，从而加速凋亡.因此，该区域甲状腺滤泡细胞萎缩、破坏较多.相反，远离淋巴滤泡区域甲状腺滤泡Bcl-2高表达，Bax低表达，由此抑制凋亡.在浸润淋巴滤泡附近的同一完整甲状腺滤泡上，其近侧端的Bax免疫染色淡，远离侧相对较强，显示Bax表达不同;而且，均有PCNA共表达.这可能与相应甲状腺滤泡细胞Bax的表达及酶解存在差异有关，是否有TSH的作用，有待于进一步探讨.HT中，部分甲状腺滤泡细胞PCNA与Bcl-2或Bax呈共表达.其机制与诸下因素可能有关:①Bcl-2可抑制Bax放大了的Fas凋亡级联.但Bcl-2，Bax只有定位于线粒体膜的内外侧才能发挥其调节凋亡功能［11-13］ .所以，不能仅从其表达来判定细胞的生存状态、凋亡或增殖;②数种Fas通道抑制剂的存在.如FAP-1，FLIP，Bcl-2等，已被确认并可防止甲状腺滤泡细胞凋亡［14］ ;③c-Myc与Fas/FasL凋亡途径存在偶联，其诱导细胞增殖与凋亡的双重作用，使两条独立事件又有了共同的中介者，根据细胞生存环境的状况通过中介者的表达，以决定细胞增殖或凋亡［15］ .Kashima等［16］ 对GD的研究认为，c-Myc的表达与HLA-DR和PCNA的表达高度相关，HT中亦发现有c-Myc表达.其作用有待研究.
　　
　　综上所述，HT中甲状腺滤泡细胞凋亡与增殖活动均活跃，凋亡水平增高更为显著;浸润淋巴细胞增殖活跃，凋亡少见.部分甲状腺滤泡细胞PCNA与Bcl-2或Bax共表达现象，揭示了HT中细胞凋亡和增殖可能存在偶联.其凋亡和增殖的失平衡可能是HT病理改变的主要机制之一.
　　

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