作者：张智勇，窦科峰，刘正才
【关键词】 免疫组织化学，
关键词: 蛋白质p73，蛋白质p53;胆管癌;免疫组织化学
摘 要:目的 探讨基因p73和p53在肝外胆管癌（ECHC）中的表达情况、相互关系及其临床病理意义. 方法 采用免疫组织化学（SABC法）对41例肝外胆管癌及10例胆总管囊肿病例p73和p53表达进行研究. 结果 p73基因阳性表达率为41%（17/41），p53基因阳性表达率为34%（14/41），14例中10例p73表达亦为阳性，其余27例中未发现p53基因突变，但其中7例表达p73.胆总管囊肿均为阴性.经统计学分析p73的表达与ECHC的临床病理分级、分期无关（P&>0.05）;而p73和p53表达显著相关（r=0.52，P&<0.05）. 结论 p73，p53基因在肝外胆管癌的发生发展过程中起重要作用，二者的表达有一定的相关性.
Keywords:protein p73;protein p53;cholangiocarcinoma;immunohistochemistry
Abstract:AIM To study p73and p53gene expressions in extrahepatic cholangiocarcinoma（ECHC）and their clinico-pathological significance.METHODS Immunohistochemical method（SABC）was used to detect the p73and p53gene ex-pressions in41cases of ECHC and10cases of choledo┐chocyst.RESULTS Positive rates of p73and p53gene were41%（17/41），34%（14/41）resepectively.10of the14cases were also stained positive for p73.In contrast，in the rest of the patients（27）without any detectable p53mutation，7ex-hibited p73immunostaining.Neither p73nor p53was detect-ed in choledochocyst.There was no significant difference in expression of p73between tumor grade and heson stage.But expression of p73was significantly correlated to that of p53（r=0.52，P&<0.05）.CONCLUSION Both p73and p53genes play an important role in the development of ECHC.The expressions of p73and p53in ECHC are significantly correlated.
0 引言
肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，ECHC）不很常见，恶性度很高，疗效很差.p73基因是近年发现的p53家族的新成员，我们检测了ECHC中p73和p53基因的表达，探讨ECHC中二者间的关系及其临床病理意义.
1 材料和方法
1.1 材料 ECHC41例和胆总管囊肿标本10例均取自西京医院病理科手术标本.HE染色复查诊断并按WHO病理学分级标准和Heson分期标准:高分化癌20例，中分化癌14例，低分化癌7例.其中Ⅰ期18例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例.羊抗人p73多克隆抗体，Santa Cruz公司出品.鼠抗人p53mAb，Sigma公司产品.SABC免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品.DAB为Sigma公司产品.
1.2 方法 标本经40g・L-1 甲醛固定，常规石蜡包埋，均作4μm连续切片.按SABC免疫组化染色步骤进行，其间行3mol・L-1 尿素溶液消化30min，0.01moL・L-1 枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）中微波修复抗原15min，一抗1∶50稀释，4℃过夜.显色后苏木精衬染，设空白对照，PBS代替一抗的阴性对照，及已知的阳性对照.结果判断:细胞核呈现清晰的棕黄色颗粒为阳性.按阳性细胞所占的比例及显色深度分为:阳性细胞&>50%，显色深，颗粒粗;:阳性细胞数30%～50%，显色较深;+:阳性细胞数&<30%，显色浅，颗粒细.细胞质、核未见染色为阴性.
统计学处理:χ2 检验和非参数相关性分析（Nosa统计软件包处理）.
2 结果
2.1 p73基因的表达 阳性物质位于胞核中，色棕黄，颗粒细，分布均匀.强表达颗粒粗，阳性率41%，胞质偶见染色（Fig1）.在整个肿瘤中，着色强度是均匀的未出现局限的强表达，在胆总管囊肿中未见阳性表达，二者相比具有显著性差别（P&<0.05）.未发现p73的表达与其他组织病理参数有关，与肿瘤的大小、细胞分化程度及肿瘤分期均无关（Tab1）.
2.2 p53基因的表达 p53阳性物质位于胞核中，色棕黄，颗粒细，分布均匀（Fig1），阳性率34%.同样在胆总管囊肿中未见阳性表达，二者相比具有显著差别（P&<0.05）.p53的表达与细胞分化程度呈负相关（P&<0.05），高分化ECHC阳性率为15%（3/20），中分化为50%（7/14），低分化为57%（4/7）.没有发现和其他组织病理参数有关.
2.3 p73与p53的相互关系 我们对p73免疫组化染色的标本同时进行了p53的染色，41例ECHC标 本中p73阳性率为41%，p53阳性率为34%，其中有10例共同表达，经2×2交叉分类资料检验及非参数相关性分析结果显示，p73和p53在ECHC中的表达呈相关（r=0.52，P&<0.05）.
表1 p73表达与ECHC临床病理特征的关系 略
3 讨论
p73基因与肿瘤发生关系密切［1，2］ .在胆管癌的研究方面报道甚少.我们发现部分肿瘤细胞的细胞核内及部分胞质中均可见表达p73蛋白.细胞核表达表明p73蛋白作为核内蛋白可以参与肿瘤细胞核内基因调控过程，而细胞质表达则提示p73蛋白在细胞质核蛋白体合成.在肝外胆管癌中，p73的表达率为41%，而在良性的胆总管肿瘤中未见表达，二者具有显著差异（P&<0.05），而p73基因的表达与ECHC的临床病理特征未见相关性（P&>0.05）p73基因在人类ECHC的发生、发展中有较为重要的作用.但具体作用机制有待于进一步研究［3，4］ .
p53作为公认的肿瘤抑制基因，在很多肿瘤均有异常表达［5-7］ ，我们发现在ECHE中，p53的表达率为34%，而在良性胆总管肿瘤中未见表达，二者之间具有显著差异（P&<0.05）.而在不同的病理分级中p53表达具有显著性差异（P&<0.05），肿瘤恶性程度越高p53表达越低，反之亦然.在本组41例肿瘤的研究中，p73与p53基因同时表达10例，共同表达缺失21例，经配对χ 检验及非参数相关性分析表明（r=0.52，P&<0.05），表明p73和p53的表达具有相关性.
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