作者：翟惠虹 时永全 郭新宁 王新 兰梅 杨力 樊代明
【关键词】 人核糖体蛋白L23
关键词: 人核糖体蛋白L23;聚合酶链反应;肿瘤;转染
摘 要:目的 扩增人核糖体蛋白L23（RPL23）编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系. 方法 按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列.PCR产物经DNA序列测定证实后，通过双酶切，将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）中，酶切电泳鉴定.采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1（+）-RPL23转染SGC7901细胞，pcDNA3.1（+）-anRPL23转染SGC7901/VCR细胞，经G418筛选后，随机挑选细胞克隆.通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23mRNA表达水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩增获得大小约0.5kb的特异性片段.经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致.重组正义真核表达载体pcDNA3.1（+）-RPL23双酶切产生大小约5.4kb，0.5kb的片段;重组反义真核表达载体pcDNA3.1（+）-anRPL23双酶切产生大小约5.4kb，0.5kb的片段，均与预期结果相符.转染细胞经筛选后，随机挑选，扩增了2个细胞克隆，斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降，而正义转染后其表达水平明显增加. 结论 成功克隆了人RPL23编码基因序列，并构建了其正、反义真核表达载体.在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株，正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑.
Keywords:human ribosomal protein L23（RPL23）;poly-merase chain reaction;neoplasms;transfection
Abstract:AIM To obtain human RPL23encoding gene，construct its sense，antisense eukaryotic vectors and transfect into gastric cancer cell line and vincristine-resistant gastric cancer cell variant SGC7901/VCR in order to describe the as-sociation of human ribosomal protein L23（RPL23）with MDR phenotypes of SGC7901/VCR cells.METHODS hRPL23cDNA was amplified with RT-PCR.Primes were de-signed according to the reported nuclear acid sequence of the gene.Using total RNA isolation kit，total RNA was isolated from cultured vincristine-resistant gastric cancer cell variant SGC7901/VCR which had high expression of RPL23，and then reversely transcripted to cDNA.PCR product was con-firmed by DNA sequencing and then directionally cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1（+）in two different directions using endonuclease sites.The two recombinant vectors were identified by endonuclease digestion.Sense，an-tisense recombinant vector was transfected into SGC7901cell line and SGC7901/VCR cell using lipofectamine.Positive clones were selected by G418and RPL23mRNA level was detected by dot blot hybridization.RESULTS 0.5kb frag-ment was obtained by RT-PCR whose sequence was consis-tent with hRPL23cDNA reported in the literature.The re-combinant sense vector pcDNA3.1（+）-RPL23and antisense vector pcDNA3.1（+）-anRPL23generated two fragments of5.4kb and0.5kb by endonuclease digestion.The results ac-cord with those expected.After G418selection，two clones of transfected cell were cultured and steadily expressed sense RPL23，antisense RPL23.Dot blot hybridization showed a low level of RPL23mRNA in SGC7901/VCR-anRPL23cells and a high level of RPL23mRNA in SGC7901cells.CON┐CLUSION hRPL23encoding gene is successfully amplified with RT-PCR and its sense，antisense eukaryotic vectors are successfully constructed.The RPL23sense RNA canbe ex-pressed steadily in human gastric cancer cell line SGC7901and higher RPL23mRNA level，while RPL23antisense RNA can be expressed steadily in Vincristine-resistant gastric can-cer cell variant SGC7901/VCR and lower RPL23mRNA lev-el.
0 引言
肿瘤细胞的多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制主要涉及P-gp，MRP，LRP，BCRP，GSH/GST，PKC，TopoⅡ，DNA修复，多种凋亡相关基因和肿瘤细胞生活的内外环境（如pH，缺氧，温度）变化［1-4］ .但胃癌MDR有其特殊性，现有的MDR机制还不能圆满解释和逆转胃癌的多药耐药性.因此，王新等［5］ 利用改良mRNA差异显示技术，从RNA水平筛选出胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR高表达的cDNA片段之一:人核糖体蛋白L23（RPL23）.在此基础上，我们拟通过RT-PCR，从SGC7901/VCR中扩增出RPL23编码区的完整序列，经测序证实后，借助分子克隆和基因转染技术获得RPL23表达上调及下调的抗性细胞，并初步证实其稳定表达，为下一步研究奠定了实验基础.
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli DH5α菌种，载体pcDNA3.1（+），胃癌细胞系SGC7901和胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR，均为本室保存的菌种与细胞.pUCm-T载体和Oligo（dT）18 ，T4 DNA连接酶，Taq酶，寡核苷酸探针合成购自上海生工公司.MMLV反转录酶，dNTPs为MBI产品.RPL23引物由上海生工公司合成（上游引物:5’-GTTAAAGATGTC-GAAGCGAGGA-3’;下游引物:5’-ACTGGA-GAATCATGCAATGCTG-3’）.柱离心式DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒为上海华舜公司产品.新生牛血清，RPM1640，脂质体lipofectAmi-neTM2000，均为Gibco公司产品.限制性内切酶，探针标记试剂盒购自华美公司.硝酸纤维素膜为Sigma产品.［α-32 P］dATP购自北京亚辉公司.
1.2 方法 收获对数生长期的胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR，按总RNA提取试剂盒说明提取 细胞总RNA.cDNA第一链的合成参考MMLV逆转录酶说明书进行.取4.8μg总RNA，加入0.5g・L-1 Oligo（dT）L81μL并以无RNA酶的去离子水补至10μL，混匀后于70℃温育5min后立即置冰上5min.继续加入5×逆转录酶缓冲液4μL，10mmol・L-1 dNTPs2μL，无RNA酶的去离子水1.5μL，于37℃保温5min，再加入MMLV逆转录酶1μL（200U），混匀后于42℃保温1h.扩增RPL23的PCR反应体系为:cDNA模板1μL，50mmol・L-1 上游引物1μL，50mmol・L-1 下游引物1μL，10mmol・L-1 dNTPs1μL，10×DNA聚合酶缓冲液5μL，50×cDNA advantage polymerase1μL，加去离子水补至50μL，PCR反应参数为:94℃变性5min后，循环94℃变性50s，48℃复性50s，72℃延伸1min，循环35次，最后1次循环结束后于72℃继续延伸15min.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，以胶回收试剂盒回收纯化并按常规方法与pUCm-T载体进行重组.重组载体pUCm-T/RPL23经蓝白筛选和限制酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司进行DNA序列测定.根据DNA重组的方法，将目的基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）构建正反义真核表达载体.具体方法如下:取pcDNA3.1（+）质粒4μg用EcoRV，XbaⅠ各8U在37℃水浴4h，电泳证实已完全线性化后，在胶上回收.将重组的pUCm-T/RPL23质粒4μg加入EcoRV，XbaⅠ各8U，酶切6h，电泳，从胶上切取0.49kb片段，纯化回收后，与pcDNA3.1（+）的酶切产物按常规方法进行重组，重组正义真核表达载体pcDNA3.1（+）-RPL23经HindⅢ，XbaⅠ双酶切电泳鉴定.同法，以EcoRV，BamHⅠ双酶切pUCm-T/RPL23及pcD-NA3.1（+）构建反义真核表达载体pcDNA3.1（+）-anRPL23，HindⅢ，XbaⅠ双酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.2.1 基因转染和克隆筛选 按每孔1×105 细胞数在24孔板中接种对数期生长的SGC7901及SGC7901/VCR细胞，常规培养过夜，直到细胞80%融合.用无血清RPM1640培养液换液备转染.实验分6组:正义RPL23转SGC7901组，空载体pcD-NA3.1（+）对照组，非转染的空白组，反义RPL23转SGC7901/VCR组，空载体pcDNA3.1（+）对照组，非转染的空白组.分别配制A液:50μL无血清RPM1640培养液（6组分别加入1μg pcDNA3.1（+）-RPL23质粒或pcDNA3.1（+）-anRPL23质粒或pcDNA3.1（+）质粒或不加任何质粒），B液:50μL无血清RPM1640培养液加入2μL lipofec-taminetm 2000脂质体.将A，B液混合，室温放置20min.分别加入A，B混合液，置CO2 孵箱培养6h后，更换为含100mL・L-1 小牛血清的RPM1640培养液，继续培养48h.将各组细胞以1∶10倍比稀释后，换用含G418的筛选培养液（G418浓度为300mg・L-1 ）继续培养2wk后，随机挑取转染组细胞克隆及对照组克隆，扩大培养，分别命名为:SGC7901-RPL23，SGC7901-pc，SGC7901/VCR-anRPL23，SGC7901/VCR-pc细胞.
1.2.2 转染细胞的鉴定 用试剂盒提取6组细胞的总RNA，经紫外分光比色后，分别取10μg RNA样品，点样于硝酸纤维素滤膜，80℃烤膜2h后，将膜置于含500g・L-1 甲酰胺，5×SSC，2×Denhardt，1g・L-1 SDS及100mg・L-1 变性鲑精DNA的预杂交液中，在42℃水浴中预杂交3h.同时取25ng RPL23的PCR产物，及100ng GAPDH（GAPDH的寡核苷酸探针为:5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’），使用α-32 P ATP末端标记法制备探针.标记好的探针加入预杂交液中，在42℃杂交过夜.洗膜，压片，置于-70℃，72h后显影.
2 结果
2.1 RPL23cDNA编码区的扩增克隆及测序 应用RT-PCR成功地从胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出一条约0.5kb的cDNA片段.通过T-A克隆法将该cDNA片段重组入pUCm-T，重组载体的限制性酶切鉴定如Fig1所示.DNA测序结果表明，所获cDNA片段的序列与GenBank中的RPL23序列完全相符.
图1 略
2.2 正、反义真核表达载体的构建 将pcDNA3.1（+）与目的基因的两种方向连接产生的重组质粒用HindⅢ，XbaⅠ双酶切，电泳结果如Fig2所示.正向连接的重组质粒产生大小约5.4kb与0.5kb两个条带，反向连接的重组质粒产生约5.4kb与0.5kb的两个条带，从而证实了目的基因已分别按正反两个方向成功地克隆到pcDNA3.1（+）多克隆位点的EcoRV/XbaⅠ或EcoRV/BamHⅠ位点之间.将两种重组质粒分别命名为pcDNA3.1（+）-RPL23与pcDNA3.1（+）-anRPL23（Fig3）.
2.3 转染细胞克隆的挑选 G418筛选2wk后，空白组细胞全部死亡，见转染组，对照组有抗性细胞克隆形成.共随机挑选转染组及对照组细胞2个克隆，扩大培养.
2.4 RPL23基因的表达 核酸斑点杂交证实（Fig4），相同上样量的总RNA中，未转染组及对照组呈现相似的杂交信号.正义RPL23转导株以RPL23的PCR产物为探针杂交时，其杂交信号明显强于非转导株.反义RPL23转导株以此探针杂交时，杂交显影强度略低于非转导株.6种细胞中GAPDH杂交信号强度相似.
图4 略
3 讨论
在对胃癌MDR机制的研究中发现，未化疗患者的胃癌组织中，有MRP，P-gp，LRP蛋白或其基因的过度表达，其中MRP最高，LRP最低，P-gp介于二者之间，而且MRP的阳性表达与胃癌的化疗敏感性密切相关.我所韩军良等［6］ 研究显示胃癌组织中MRP表达高于P-gp，且显著高于非胃粘膜组织，MRP的阳性率与胃癌的临床分期，分化程度相关.而用米托蒽酚（mitoxantrone）诱导的耐药胃癌细胞中均有BCRP的过度表达［7］ .韩等［8］ 研究显示胃癌SGC7901细胞及其耐药细胞亚系SGC7901/VCR中有P-gp的表达，且耐药细胞中P-gp表达增高.
但不同组织来源的肿瘤其MDR机制不尽相同.Chung等［9］ 建立了两个5-FU耐药的胃癌细胞亚系，发现胸苷激酶（TK）表达明显增加，提示TK在阻断5-FU与核酸结合的过程中起重要作用.Kim等［10］ 将可诱导细胞生长抑制和DNA损害的gadd153基因转入胃癌细胞MKN45中，发现其对CDDP和VP-16的敏感性显著增加;进一步研究证实其敏感性增加与细胞的凋亡有关，但耐药性与MKN45gadd153细胞中mdr-1，MRP和TopoⅡ基因的表达无关.蔡等［11］ 建立了SGC7901/VCR，SGC7901/ADM，SGC7901/5-FU和SGC7901/MTX4株胃癌耐药细胞亚株，流式细胞仪检测亲本细胞和耐药细胞均有P-gp的表达，但耐药细胞呈显著高表达，提示P-gp与这些细胞的耐药性有关.肖等［12］ 将抗凋亡基因bcl-2反义核酸转染SGC7901和SGC7901/VCR细胞，结果SGC7901细胞对顺铂和5-FU的敏感性明 显增强，SGC7901/VCR的敏感性无改变;而将fas基因转入SGC7901/VCR细胞后，可部分逆转其耐药性.提示这些基因及其蛋白均参与了SGC7901/VCR细胞的耐药过程.
为了探讨RPL23与胃癌长春新碱耐药的关系，我们采用分子克隆技术，成功地构建了正、反义真核表达载体pcDNA3.1（+）-RPL23，pcDNA3.1（+）-anRPL23，用脂质体介导的转染技术，将两个重组表达载体分别转导胃癌细胞及耐药细胞中，通过抗性筛选，有效地建立了RPL23高表达的胃癌细胞株:SGC7901-RPL23及RPL23低表达的胃癌耐药细胞株:SGC7901-anRPL23.核酸分子杂交结果显示，正义RPL23转导株的RPL23mRNA的表达明显高于非转导株，而反义RPL23转导株的表达明显低于非转导株.以上工作为进一步研究RPL23基因表达的改变对胃癌多药耐药性的影响提供了基础.
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