关键词: GABA;受体，阿片样，μ;水管周灰质;显微镜检查，共焦;免疫组织化学;大鼠
摘 要:目的 观察中脑导水管周围灰质（PAG）内是否存在γ-氨基丁酸（GABA）与阿片μ受体（MOR）共存神经元. 方法 免疫荧光组织化学双重染色技术，染色结果在激光扫描共聚焦显微镜下观察. 结果 GABA阳性神经元主要见于PAG中、尾段内侧区和腹外侧区，阳性神经元多散在分布并多为小型，中型者较少;散在分布的MOR阳性神经元主要见于PAG中、尾段的腹外侧区，多为中、小型神经元;散在并同时呈GABA和MOR双重染色阳性的中、小型神经元主要见于PAG中、尾段的腹外侧区. 结论 PAG内有GABA与MOR共存的神经元，提示内源性阿片物质对PAG内的GABA能神经元可能有调控作用.
Keywords:GABA;receptors，opioid，mu;periaqueductal gray;microscopy，confocal;immunohis-tochemistry;rats
Abstract:AIM To observe whetherγ-aminobutyric acid（GABA）andμopioid receptor（MOR）co-exist in neurons of the periaqueductal gray（PAG）in the rat.METHODS Im-munofluorescent histochemical double-staining technique was used.The staining results were observed with laser scanning confocal microscope.RESULTS GABA-immunoreactive（GABA-IR）neurons were mainly seen in the medial and ven-trolateral subregions at the middle and caudal levels of the PAG.Most of the sparsely distributed GABA-IR neurons were small-sized and the number of medium-sized GABA-IR neurons was small.Scattered MOR-IR neurons were mainly observed in the ventrolateral subregion at the middle and cau-dal levels of the PAG.Most of the MOR-IR neurons were small-and medium-sized.Small-and medium-sized neurons simultaneously showing both GABA-IR and MOR-IR were scattered in the ventrolateral subregion at the middle and cau-dal levels of the PAG.CONCLUSION There are GABA and MOR co-existing neurons in the PAG.The present results suggest that endogenous opioid-like substances might regu-late GABAergic neurons in the PAG.
0 引言
以往的研究证明，中脑导水管周围灰质（PAG）内5-羟色胺（5-HT）能下行投射系统在调控伤害性信息向中枢的传入过程中发挥着重要作用，而γ-氨基丁酸（GABA）对5-HT能神经元具有抑制性调控作用［1-4］ .有人曾报道激活中枢神经系统内的阿片μ受体（μopioid receptor，MOR）具有直接调节GABA能神经元活动的作用［5］ .激活MOR后调节GABA能神经元活动的结果能使PAG的下行投射神经元摆脱GABA能神经元的抑制（disinhibition，脱抑制）并发挥镇痛作用［6］ .但PAG内的GABA能抑制性神经元是否呈MOR阳性，尚缺乏直接的形态学证据.本研究用免疫荧光组织化学双重染色技术，在激光扫描共聚焦显微镜下对PAG内GABA与MOR共存的神经元进行了观察.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量200～250g.戊巴比妥钠（4g・L-1 ）经腹腔深麻下开胸，经左心室插管至升主动脉，先以150mL的9g・L-1 生理盐水冲洗，再用含40g・L-1 多聚甲醛和2g・L-1 苦味酸的0.1mol・L-1 磷酸缓冲液（PB，pH7.4）500mL灌注固定，灌注完毕立即取脑，置于上述新鲜固定液后固定4～6h，再移入含300g・L-1 蔗糖的PB中至组织块沉底（4℃）.将中脑用恒冷箱作连续冠状切片，片厚15μm，切片隔2取1，分3组收集.用0.01mol・L-1 的PBS（pH7.4）充分清洗切片.
1.2 方法 按ABC方法对第1组切片进行免疫组织化学染色，具体步骤如下:①入兔抗GABA血清（1∶1000;Chemicon）与豚鼠抗MOR血清（1∶1000;Ding等［7］ ）混合液，室温孵育18～24h;②入Biotin标记的驴抗兔IgG（1∶250;Jackson），室温孵育3h;③入FITC标记的Avidin（1∶3000;Vec-tor）和Texas Red标记的驴抗兔IgG（1∶200;Jack-son），室温孵育3h.上述抗体和复合物的稀释均用含3g・L-1 的Triton X-100和5g・L-1 正常马血清的PBS，各步骤之间均用PBS彻底清洗切片.裱片，避光干燥，甘油与PBS（1∶1）混合液封片，激光扫描共聚焦显微镜观察并摄片.用正常兔血清和正常豚鼠血清的混合液代替兔抗GABA血清和豚鼠抗MOR血清孵育第2组切片，其余染色方法同第1组切片，进行替代对照实验，结果为阴性.将第3组切片用于Nissl染色，以便对照观察和定位免疫组织化学染色的阳性结果.
2 结果
本研究按Beitz的方法将PAG划分为吻、中和尾三段，各段均划分为内侧区、背侧区、背外侧区和腹外侧区，内侧区包绕在导水管周围［8］ .GABA的免疫荧光染色阳性产物位于细胞质，胞核内的阳性产物较少（Fig1a～d）.GABA阳性神经元散在分布于PAG全长的各区，但中、尾段内侧区和腹外侧区内的GA-BA阳性神经元的数量明显多于其它区域.GABA阳性神经元多为小型，胞体呈三角形（Fig1a）、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d），阳性神经元的长径多在10～20μm之间;中型（21～30μm）梭形、圆形、三角形和多角形的GABA阳性神经元较少.
MOR的免疫荧光染色阳性产物主要位于细胞膜和突起的膜上，细胞质和细胞核内的阳性产物较少（Fig1a～d）.散在分布的MOR阳性神经元也见于PAG全长的各区，中等密度且染色较深的MOR阳性神经元仅见于PAG中、尾段的腹外侧区.MOR阳性神经元多为中、小型三角形（Fig1a）、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d）神经元;大型（&>30μm）阳性神经元和多角形的MOR阳性神经元较少见. 在PAG全长的各区内均能见到少量的神经元同时呈GABA和MOR免疫荧光组织化学染色阳性（Fig1a～d），GABA/MOR双标神经元也主要呈三角形（Fig1a）、圆形（Fig1b）和梭形（Fig1c，d），双标神经元也主要见于PAG中、尾段的腹外侧区（Fig1a）.
3 讨论
中枢内具有调控伤害性信息传递作用的内源性下行抑制系统的主要组成结构是PAG、延髓吻端腹内侧部（rostral ventromedial medulla，RVM）和脑干中缝核簇，该系统在调控伤害性信息向中枢的传入方面起着重要作用［1-4］ .PAG在下行抑制系统中处在承上启下的关键地位，在启动和激活下行抑制系统的过程中具有举足轻重的作用.5-HT是下行抑制系统的下行投射纤维的主要神经活性物质，GABA是广泛地存在于哺乳动物中枢神经系统（CNS）的一种重要的抑制性神经递质，多数GABA能神经元属于中间神经元［1，2，6，9］ .我们以往的研究已经证明中枢内源性镇痛系统内有GABAB 受体阳性神经元和5-HT与GABAB 受体共存神经元，GABA阳性终末与5-HT和GABAB 受体共存神经元形成密切接触［10，11］ ，提示下行抑制系统内的GABA阳性终末可能通过GABAB 受体对5-HT能下行投射神经元起着持续性抑制性调控作用.
阿片受体具有多样性和多源性.目前已知中枢内至少存在三类阿片受体（μ，δ和κ受体），各类受体有不同的亚型［12，13］ .一般认为，CNS内MOR介导内源性阿片样物质和吗啡的镇痛效应，具有直接调节GABA能神经元的作用［5，7］ .PAG内可能存在调控下行抑制系统的抑制性局部环路，该环路主要由GABA能神经元和含内源性阿片样物质的终末组成［14］ ，含内源性阿片样物质的终末通过MOR对GABA能神经元具有抑制作用［5］ . PAG内的GABA能神经元是否也呈MOR阳性，尚无直接的形态学依据.我们观察到PAG内有GABA阳性神经元，它们可能属于对PAG内5-HT能下行投射神经元具有的持续性抑制作用的中间神经元.此外，我们还在PAG内观察到部分神经元同时呈GABA和MOR阳性，GABA/MOR共存神经元主要分布在PAG中、尾段的腹外侧区.上述结果说明PAG内的GABA能神经元表达MOR，MOR是内源性阿片样物质的特异性结合位点;含内源性阿片样物质的终末可通过与MOR的结合，使GABA能抑制中间神经元的抑制效应减弱或消失，导致PAG向RVM发出下行投射的5-HT能神经元摆脱GABA能神经元的抑制（脱抑制），激活RVM内向脊髓和延髓背角的5-HT能下行投射系统并直接发挥镇痛效应.本研究结果为以上假设提供了直接的形态学依据，也说明PAG是调控下行抑制系统并抑制外周伤害性信息向中枢传递的重要结构.
图1 略
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