关于对山东地区TTV基因片段的检测及其部分核酸序列测定

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　　　　　　作者：于建国　商庆华　任 浩　肖德明　尹燕明　白 薇　戚中田　张光曙

【关键词】 输血传播
　　关键词: 输血传播，病毒;肝炎，非甲～戊型;核酸，序列
　　摘 要:目的 了解山东地区输血传播病毒（TTV）分离株感染状况及基因变异的情况. 方法 应用逆转录―聚合酶链反应法（RT-PCR）检测山东地区26例非甲～戊型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中的TTV DNA，对阳性扩增的产物进行测序，并分析其基因变异情况. 结果 26例非甲～戊型肝炎患者检出TTV DNA阳性者11例（42%）.对其中2例（TTVSD4，TTVSD5）进行PCR产物直接测序，并与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性分别为99.9%和100%.而12例肝细胞癌患者中TTVDNA阳性3例（25%），对其中1例（TTVSD6）测序，与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性为99%;TTVSD4、TTVSD5和TTVSD6之间的核苷酸同源性均为99%. 结论 山东地区非甲～戊型肝炎和肝细胞癌患者中TTV感染率较高，测序结果表明其与日本株（AB008394）有较高的同源性.
　　
　　Keywords:transfusion transmitted virus;nonA-E hepatitis;Nucleotide sequence
　　
　　Abstract:AIM To investigate the prevalence of TTV infec-tion and genetic variation of TTV isolate in Shandong Province.METHODS TTV DNA were amplified and de-tected by RT-PCR methods from sera of patients with nonA-E hepatitis（n=26）and hepatocellular carcinoma（n=12）.The positive PCR products were sequenced and analyzed for genetic variation.RESULTS TTV DNA were detectable in11of26patients（42.3%）with nonA-E hepatitis.Two of them（TTVSD4，TTVSD5）were sequenced and compared with known sequence of TTV isolates in Japan（AB008394）.The nucleotide homology was99%and100%.TTV DNA was positive in3of12patients（25%）with hepatocellular carcinoma.One of them（TTVSD6）was sequenced and com-pared with AB008394.The nucleotide homology was99%.CONCLUSION TTV infection is high in the nonA-E hepati-tis and hepatocellular carcinoma patients in Shandong province.The secquence results showed that the TTV isolate in Shandong province has high homology with TTV isolate AB008394in Japan.
　　
　　0 引言
　　
　　以往研究认为，TTV感染具有致病性，同输血或血制品密切相关，可能是导致肝功能长期损害的又一致病因子.为探讨山东地区非甲～庚肝炎和肝癌患者TTV感染状况和基因变异的情况，并阐明TTV在人类肝炎中的作用、地位及其传播途径，我们检测了非甲～戊型肝炎和肝癌患者血清中TTV的感染率，并对其中3例TTV阳性患者进行序列分析.
　　
　　1 对象和方法
　　
　　1.1 对象 1998-03/2000-09解放军第88医院、济南军区肝病研究所、泰安市中心医院和泰山医学院附属医院临床与病理确诊为非甲～庚肝炎患者26（男19，女7）例，平均年龄（37±1.4）岁.患者有输血或输血制品、手术、拔牙、针灸、注射以及与肝炎患者密切接触史者17例.这些非甲～戊型肝炎排除甲～庚型肝病毒、EBV、CMV感染.肝癌患者12（男8，女4）例，平均年龄（34±8.8）岁.其中有输血或输血制品、手术、拔牙、静脉注射史者10例.临床排除甲～庚型肝炎病毒、EBV、CMV感染.空腹抽血5mL，分离血清，分装后置-80℃冰柜保存备用，采血同时进行流行病学调查.
　　
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 TTV DNA提取 取血清100μL加300μL裂解液［13.3mmol L-1 Tris-HCL，pH8.0，6.7mmol L-1 乙二胺四乙酸（EDTA），6.7g L-1 十二烷基硫酸钠（SDS），133mg L-1 蛋白酶K］.70℃水浴1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于20μL1×TE中.
　　1.2.2 PCR扩增 参照TTV日本株序列设计2套引物，由上海生工生物工程有限公司合成.分别为:S1:5’-CCATTCACAGACAGAGGAGAAGGC-3’，S2:5’-CTAATAAGAAGTCCCTTTACAGACCC-3’，AS1:5’-GGAGTGGGTTTCGGGGCAGGG-3’，其中，S1/AS1为外引物，S2/AS1为内引物，预期扩增片段为323bp;S3:5’-CAATAGAGTCCCTAGAA-GCTTA CA-3’，AS3:5’-GGTAACAAG-GTAGGGTTGATATC-3’，S4:5’-GGAACTCA-CATTCCATACCTG-3’，AS4:5’-GTTTGACTC-CCAGGATTCG-3’，其中S3/AS3为外引物，S4/AS4为内引物，预期扩增片段为329bp.PCR试剂购自Progema公司.PCR扩增条件:取模板5μL，10×Taq缓冲液5μL，dNTP0.1mmol L-1 和Taq酶1U，引物浓度均为0.3μmol L-1 ，共50μL反应体积;取第1次PCR产物5μL作模板，其他同第1轮.循环条件均为:94℃预变性180s，94℃35s，56℃35s，72℃45s，扩增30个循环，72℃延伸8min.取第2次PCR产物15μL20g L-1 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果.
　　
　　1.2.3 序列测定和分析 PCR产物纯化后用PE公司的ABI Prism377DNA自动测序仪行PCR产物直接测序，测序引物为S4/AS4，将所测序列通过In-ternet Blast进行同源性分析.
　　
　　2 结果
　　
　　26例非甲～庚肝炎和12例肝细胞癌患者血清中TTV DNA阳性检出率分别为24%（11/26）和25%（3/12）.对PCR阳性产物直接测序，Internet Blast检索结果表明山东TTVSD4、TTVSD5和TTVSD6与日本TTV原型（基因1a）TA278（AB008394）［1］ 相应部位核苷酸序列同源性分别为99%、100%和99%，此3株间核苷酸同源性也达99%以上（Fig1）.
　　
　　图1 略
　　3 讨论
　　
　　1997年，Nishizawa等［2］ 利用代表差异分析（rep-resentational difference analysis，RDA）技术，从一例输血后肝炎患者血清中成功获得长500bp的基因克隆（N22克隆）.后验证N22克隆系无包膜单股DNA病毒，基因组全长约3739bp.随后我国周育森等［3］ 用PCR技术从一例急性非甲～戊型肝炎患者血清中克隆出298bp片段，经分析与日本发表的序列同源性为98%.1998年我们成功克隆了2株TTVSD1（AF416139）、TTVSD2（AF416140）部分基因序列［4］ .经分析证实TTVSD1与日本株（ABOO8394）和中国第1株（CTTVCHN01）核苷酸序列同源性均为94%;TTVSD2与上述日本和中国株相比较核苷酸序列同源性分别为91%和93%;TTV山东2株间序列同源性为91%.提示TTVSD1、TTVSD2分离株和中国第1株与日本株相比较可能归属于一个亚型.
　　我国是多种肝炎病毒感染发病率较高的国家，有相当部分肝炎患者是经输血或血制品途径感染的.庚型肝炎病毒（HGV/GBV-C）自1995年被发现，有关TTV论文自1997年发表以来，国内外对其致病性一直存有争议［5-10］ .为了解TTV在中国山东地区人群中感染状况，分析其TTV山东株部分基因结构与特征，进一步开展TTV感染预防和疫苗研究.我们参照TTV日本株序列设计两套引物，用RT-PCR方法检测了TTV在非甲～戊型肝炎和肝癌患者中的感染情况.为防止因PCR操作造成的假阳性，弥补不同区域的引物造成检出率的差异，设计不同区域的两套引物以相互补充，每份标本一式两份，一份直接PCR，另一份经MBN（20U）酶切消化后PCR，同时设立阴阳性对照观察.检测结果表明，26例非甲～戊型肝炎和12例HCC患者血清中，TTV DNA阳性检出率分别为42%（11/26）和25%（3/12）.由此可见山东地区非甲～戊型肝炎患者中确存在TTVDNA，提示TTV可能是导致非甲～戊型肝炎的病原体.由于肝癌患者易暴露血液（注射、输血、针刺创伤等），提示TTV感染主要通过输血或血制品途径传播，但是否导致肝细胞癌变，则有待于进一步探讨.鉴于所选病例均有输血史或接触血制品史，表明输血或血制品是导致TTV感染的主要途径.

我们应用RT-PCR产物直接测序方法，对临床与病理确诊2例非甲～庚肝炎和1例肝癌患者进行核苷酸序列测定，结果发现TTVSD4、TTVSD5与日本原型TA278（AB008394，基因1a）核苷酸序列同源性分别为99%和100%，而TTVSD6与TA278的核苷酸序列同源性也为99%.表明本地区流行的TTV株与 TA278（AB008394）克隆进化距离较近，可能属于同一基因型.本文所报道的3株TTV分离株间的核苷酸同源性达99%以上，证明为同一种病毒的不同分离株，应归属一个基因型或亚型.TTV是一种单股DNA病毒，约3.7kb，含有ORF1和ORF2两个读码框架，编码为770与202个氨基酸.TTV感染分布广泛，在国内外人群中均存在不同程度感染，感染途径除经血液外，粪口传播也可能是一个重要传播途径［11］ .自发现TTV以来，迄今4a多的时间里，国内外已阐明TTV全基因结构，证明具有为数众多的基因型，而某些基因型株或变异株TTV感染确与肝损害病理生理改变密切相关.临床上，某些肝功能异常改变虽不重要，但足以说明TTV持续性感染与肝损害具有一定的致病性［12-15］ .现已证实，TTV存在多种混合性感染.一般为多系不同基因型株混合感染，因此进一步探索不同地区不同基因型株TTV感染同肝病之间的相互关系是十分重要的.
　　

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