作者：徐军 耿智敏 刘青光 向国安 刘效恭 韩庆 王康敏
【关键词】 胆管损伤
关键词: 胆管损伤;愈合;显微结构;超微结构
摘 要:目的 探讨良性胆管狭窄形成机制. 方法 建立犬胆总管损伤修复动物模型后，于术后3d，1，3wk，3，6mo取材分别行光镜、电镜观察及免疫组化观察巨噬细胞、转化生长因子（TGF-β1 ）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在胆管愈合过程不同时期组织中的表达强度、阳性细胞数和组织分布. 结果 光、电镜显示:炎性渗出期较长，胆道粘膜上皮愈合较慢，瘢痕组织细胞持续增生活跃，细胞外基质过度沉积，胶原纤维排列致密杂乱.肌成纤维细胞（MFB）功能活跃，持续存在于整个愈合过程中.免疫组化:巨噬细胞、转化生长因子（TGF-β1 ）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在胆管愈合过程中表达较强，且持续较长时间.MΦ阳性主要表达于胆道粘膜下固有层;TGF-β1 主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ及血管内皮细胞胞质和细胞膜;α-SMA表达于MFB质、平滑肌组织. 结论 胆管愈合方式属于过度愈合;MFB功能活跃，持续存在，是导致胆管瘢痕性挛缩的重要原因;MΦ、TGF-β1 及α-SMA高表达是造成胆管愈合过程中成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、胆管瘢痕性挛缩的重要因素.
Keywords:bile duct trauma;wound healing;microstructure;ultrastructure
Abstract:AIM To explore the mechanism of benign biliary stricture.METHODS A model of trauma of common bile duct was established in dogs and then the trauma was re-paired.Tissues were taken on the3rd day，1st week，3rd week and the3rd month，6th month respectively after opera-tion and were studied with light microscopy，electromi-croscopy，and immunohistochemical SP staining of macrophage，TGF-β1 andα-SMA respectively.RESULTS Light microscopy and electromicroscopy showed that the ep-ithelium of mucosa membrane of bile duct restored poorly，chronic inflammation lasted for a long time，fibroblast prolif-erated actively and extracellular matrix overdeposited.Thick-ening arrangement of collagenous fiber was found.Myofi-broblasts functioned actively and was observed during the whole healing process.Immunohistochemical test showed a high expression of mycrophage，TGF-β1 andα-SMA in the whole healing process and lasted a longer time.Macrophage was found in the intrinsic layer under mucosa，TGF-β1 in the granulation tissue，fibroblast and endothelial cells of blood vessels andα-SMA in the myofibroblasts.CONCLUSION The healing of bile duct is in the mode of overhealing.Myofi-broblast functions actively and lasts a longer time，which is the main cause for scar contracuture and stricture of bile duct.The high expression of macrophage，TGF-β1 andα-SMA is closely related to the active proliferation of fibrob-last，extracellular matrix overdeposition and scar contracu-ture of bile duct.
0 引言
良性胆管狭窄的处理是胆道外科的一大难题，术后突出表现为胆道瘢痕性孪缩和管腔狭窄，尤以肝门部或肝门部以上胆管狭窄为著［1］ .为了阐明良性胆管狭窄形成机制，我们通过制作犬胆总管损伤修复模型，从伤口愈合角度观察胆管损伤修复过程中的组织学变化及超微结构改变，并进一步采用免疫组化方法，观察巨噬细胞、转化生长因子（TGF-β1 ）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在胆管愈合过程不同时期组织中的表达强度、阳性细胞数和组织分布，探讨良性胆管狭窄形成机制.
1 材料和方法
1.1 材料 选用西安地区健康杂交犬28条，雌雄不限，平均体质量15.3kg.第一抗体:鼠抗人巨噬细胞（CD68）mAb、鼠抗人平滑肌肌动蛋白（Actin（Smooth）［1A4］）mAb为中山生物技术公司产品，兔TGF-β1 多抗为Santa Cruz Biotechnology，Inc产品.第二抗体:抗巨噬细胞mAb、抗α-SMA mAb为生物素标记羊抗鼠IgG，抗TGF-β1 多抗为生物素标记的羊抗兔IgG，均系ZYMED公司产品.SP试剂盒为ZYMED公司产品.
1.2 方法 以25g・L-1 硫喷妥钠1mL・kg-1 ip诱导麻醉，经右上腹腹直肌切口入腹，首先距十二指肠上缘2cm处游离出胆总管（上下游离范围不超过1cm），沿横向切开胆总管前壁，范围不超过胆总管两侧纵轴，约为其周长的1/3.用显微外科技术以5-0Dexon缝线作粘膜对粘膜外翻全层吻合，针距0.5～0.6mm，边距0.3～0.4mm.术毕探查吻合口无渗漏后关腹.术后预防感染治疗3d.观察动物的饮食、活动、反应状况，腹腔引流情况及并发症.分别于术后3d，1，3wk，3，6mo取材进行以下各项病理检查，每次取材5只.
组织学观察:光镜组织学观察:吻合口连同上、下2cm组织取材后，置入40g・L-1 甲醛溶液固定.分别行HE染色、Masson染色及Verhoeff染色，显微镜下观察.采用VIDAS图像分析仪，测量吻合口管壁胶原纤维面积百分比，观察胶原量的变化.将图像分析结果进行分层设计的方差分析，比较各期之间的统计学差异.于肉眼观察吻合口瘢痕组织相对较多区域取组织一块，低温下迅速修剪成1mm3 的小块，立即置入25mL・L-1 戊二醛液固定.用HITCH-600型透射电镜（TEM）观察并摄片.经EIKO-IB-3型离子镀膜机镀金，用KYKY-2000型扫描电镜（SEM）观察并摄片.将每个标本所摄TEM照片在VIDAS计算机图像分析仪下，测定细胞外胶原的面积变化，根据立体学分析原理，推算相对容积密度变化（ECVD）.
巨噬细胞、TGF-β1 及α-SMA表达均采用免疫组化SP法.同时作阳性及阴性对照.应用VIDAS图像分析仪，以细胞内呈棕黄色颗粒者为阳性，对各组切片单位面积阳性细胞数进行定量分析.
统计学处理:所有数据均用x ±s表示，差异性分析采用方差分析.
2 结果
术后12d1条犬死于胆瘘，2条犬于术后4～5 mo间死于梗阻性黄疸，共存活25只.术后早期食欲、活动、反应均正常，远期观察8条犬中4条3mo以上时出现食欲下降、体质量减轻、小便色深及陶土便等梗阻性黄疸表现.术后腹腔引流管平均引流30～40mL淡血性液体，混有少量胆汁.
2.1 组织学观察 术后3d吻合口胆道粘膜坏死、脱落，组织呈急性炎症反应.1wk时吻合口表面渗出减少，粘膜下均为增生的肉芽组织.胆管壁较正常增厚.Masson染色及Verhoeff染色见新生的胶原纤维排列杂乱，粘膜下弹力纤维断裂为碎段，毛细血管类似胶原样不规则排列.3wk时吻合口表面转为慢性炎症反应，胆道粘膜部分修复.吻合口周围管壁明显增厚，均为增生的纤维瘢痕组织，部分纤维组织呈玻璃样变性，小血管增生、扩张、充血.Masson染色及Verhoeff染色见粘膜下大量胶原纤维增生，排列致密呈年轮状或结节状.胶原结节中包含高密度的成纤维细胞和致密排列的无定向的胶原纤维，微血管以网状包绕在胶原结节周围.结节区缺乏弹力纤维.3mo及6mo时吻合口胆道粘膜上皮基本修复完整，但排列较为杂乱，厚度较正常粘膜层薄，粘膜下较多慢性炎症细胞浸润，固有层含少量粘液腺，增生的毛细血管较前退化.管壁较前变薄，胶原纤维排列较前整齐，但仍杂乱无序、致密（Fig1）.部分肝脏标本显示肝脏组织呈轻度瘀血、瘀胆改变.术后1wk吻合口胶原纤维面积百分比（54±4）%，3wk（69±5）%，3mo（78±4）%，6mo（72±4）%.
2.2 超微结构观察 TEM:1wk时吻合口瘢痕组织内可见成纤维细胞增生，细胞功能活跃，处于合成状态.细胞外可见大量胶原纤维，直径40～80nm，较正常为细，密集成束，排列致密，杂乱，无方向性.同时可见一定数量的MFB，细胞较大，胞体扁平，多呈梭形，细胞核形态不规则.细胞内除具有成纤维细胞样丰富的粗面内质网和发达的高尔基器外，靠近细胞膜处尚具有发育良好的微丝和密体，与细胞长轴平行排列.此外，尚可见到较多炎性细胞浸润及漏出的红细胞.
2.3 免疫组化观察 MΦ阳性细胞表达位于胆道粘膜固有层，粘膜下层较少，正常对照表达阴性.TGF-β1 表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ及血管内皮细胞胞质和细胞膜，正常胆管壁纤维组织表达较弱.α-SMA表达于MFB胞质、平滑肌组织.正常胆管表达于管壁少量平滑肌组织（Fig4，Tab1）.
图1 －图4 略
表1 MΦ，TGF-β1 ，α-SMA在胆管愈合过程中的表达 略
3 讨论
瘢痕病变部位胶原的过量沉积可导致瘢痕过度增生［2］ .良性胆管狭窄突出表现为胆道瘢痕性孪缩和管腔狭窄，但其形成机制不清.我们通过制作犬胆总管损伤修复模型，发现胆管愈合方式属于过度愈合，愈合时间延长.胆管粘膜上皮修复较差，慢性炎症持续存在，成纤维细胞增生活跃，愈合后粘膜下胶原纤维过度沉积，改建较差.结果导致瘢痕增生，吻合口狭窄发生率较高.
近年来逐渐认识到MFB与瘢痕挛缩关系密切［3］ .MFB是一种在超微结构上兼有成纤维细胞和平滑肌细胞两者特征的非典型的成纤维细胞.我们观察到胆管瘢痕组织中存在大量MFB.MFB术后1wk时开始出现，3mo时达到高峰，高峰期持续较长一段时间.细胞的生活周期与吻合口肉芽组织的增生收缩过程基本是一致的［3］ .从而证实了MFB在良性胆管狭窄形成过程中起着重要作用，是引起吻合口瘢痕性挛缩，造成术后胆道狭窄的重要原因.α-SMA作为成纤维细胞向MFB分化的标志，实际上也就成为MFB的重要标志［4，5］ .从而进一步证实了MFB是良性胆管狭窄形成的重要原因.
MΦ作为主要的炎症和免疫细胞，除参与组织炎症及免疫反应外，更重要的是通过释放多种介质，直接或间接、单独或协同影响着组织的血管化和纤维化［6，7］ .TGF-β是一种强烈的促细胞分裂剂，是目前已知与瘢痕形成关系最密切、最有代表性的生长因子，对多种细胞的分裂、繁殖和迁移起作用.因此能够诱导肉芽组织的形成，但如过度作用，将会导致瘢痕形成［8-11］ .
本实验结果显示MΦ及TGF-β1 的高表达与胆道瘢痕增生有密切关系，同时亦证实了TGF-β1 的自分泌方式.MΦ，TGF-β1 作为重要的信号传递物，单独或协同、直接或间接在细胞和细胞外基质相互作用中起重要作用，导致炎性细胞、修复细胞和胶原代谢调控失常.最终造成胆管损伤愈合过程延长、细胞外基质过度沉积、瘢痕挛缩，吻合口和胆管形成狭窄.
本实验MΦ及TGF-β1 持续表达较强的原因可能与胆汁的刺激作用引起的管壁慢性炎症有关，炎症反应持续存在造成上皮愈合后MΦ仍大量聚集，持续合成、分泌MDGF，TGF-β等多肽生长因子，导致成纤维细胞增殖旺盛，胶原过度合成，管腔瘢痕性狭窄.因此设法减少胆汁刺激引起的炎症反应的量和程度，缩短愈合时间，抑制MΦ过度浸润及其活性，将有助于减轻胆管瘢痕增生.
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