作者：尹 文 徐志凯 薛小平 马越云 刘卫东 付 莉 吕 欣
【关键词】 肝炎病毒
关键词: 肝炎病毒，乙型;C型肝炎样病毒属;细胞系
摘 要:目的 建立融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的体外培养细胞系，使之作为细胞杀伤实验的靶细胞. 方法 将含HBV S和HCV C融合基因真核表达质粒CSpcD-NA3.1用电穿孔法转染p815细胞，G418筛选后，再用有限稀释法进行单细胞克隆筛选.RT-PCR与免疫荧光法分别检测基因转录与蛋白表达. 结果 HBV S基因与HCV C基因的RT-PCR检测均为阳性，HBV表面抗原与HCV核心蛋白的免疫荧光检测均为阳性. 结论 成功获得融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的细胞系.
Keywords:hepatitis B virus;hepatitis C-like viruses;cell line
Abstract:AIM To establish the stable cell line expresssing HBV surface antigen and HCV core protein and to use it as the target cell for cytotoxic T-cell response.METHODS The p815cell was transfected by the chimeric plasmid CSpcDNA3.1including HBV S gene and HCV C gene.Clones which expressed HBV surface antigen（HBsAg）and HCV core protein（HCcAg）were selected with G418and lim-ited dilution.HBV S gene and HCV C gene were detected by RT-PCR，and HBsAg and HCcAg were detected by im-munofluorescent assay.RESULTS Transcription of HBV S gene and HCV C gene was confirmed.HBsAg and HCcAg were positive in transfected P815cells.CONCLUSION A cell line expressing HBsAg/HCcAg fusion protein was estab-lished.
0 引言
HBV与HCV具有严格的宿主特异性，不能进行人工培养，限制了特异性靶细胞系的建立［1］ .为评价药物疗效和研究DNA疫苗免疫后的CTL活性，就必须建立稳定表达特异性抗原且同时表达MHC-Ⅰ类分子的靶细胞系 ［2，3］ .我们把构建的真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法转染p815细胞，筛选出了能同时表达HBV表面抗原（HBsAg）与HCV核心蛋白（HBcAg）的稳定细胞系，为检测疫苗免疫后CTL效应奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 含HBV S（表达小蛋白）与HCV C（表达核心蛋白）融合基因的表达质粒CSpcDNA3.1由本室构建［4］ .p815细胞（小鼠肥大细胞瘤细胞）由第四军医大学免疫学教研室李德敏博士提供.Nucleo-Trap胶回收试剂盒和G418购于Clontech公司.Trizol试剂购于GibcoBRL公司.Taq DNA聚合酶购于上海Sangon公司.逆转录试剂盒购于Promega公司.RPMI Medium1640培养基、HBV表面抗原单克隆抗体、HCV核心蛋白单克隆抗体及荧光标记的羊抗鼠单克隆抗体均购于华美生物工程公司.电穿孔仪（Gene PulserⅡElectroporation system）为BIO-RAD公司产品.
1.2 方法
1.2.1 G418浓度与电穿孔参数的选择 在六孔板上培养p815细胞，待铺满板底25%面积时，加入G418，六孔终浓度分别为0，200，300，400，500，600mg・L-1 ，观察细胞成活率，2～3wk培养孔内细胞全部死亡的G418浓度为最适浓度;收集两中瓶p815细胞做电穿，过夜后在显微镜下进行活细胞计数，取60%～90%细胞存活率的条件为最适电穿孔条件［5］ .
1.2.2 质粒线性化 用BglⅡ酶切质粒CSpcD-NA3.1和pcDNA3.1，10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳回收后，用NucleoTrap试剂盒去除琼脂糖凝胶（详细步骤参看说明书）.
1.2.3 转染及克隆筛选 收集一中瓶p815细胞，离心后弃上清;加8mL1×HEBES pH7.3洗涤1次，沉淀重悬于2mL1×HEBES液中，取2份0.8mL于2个电穿孔杯中，分别加入线性化质粒CSpcD-NA3.1和pcDNA3.1，于4℃冰箱10min.电传条件950μF，230V和17.0ms.电穿后移入六孔板，加2.2mL100mL・L-1 RPMI1640培养液混匀，G418终浓度为400mg・L-1 .2～3wk后检测培养上清和培养细胞，用有限稀释法选择高表达克隆.
1.2.4 HBsAg/HCcAg mRNA的检测 Trizol法提取RNA后，用DNaseⅠ处理RNA样品.RT-PCR参照AMV Reverse transcription KIT说明书进行.
1.2.5 HBsAg和HCcAg的检测 培养上清用ELISA方法检测，培养细胞用免疫荧光法检测.收集细胞，调整细胞密度为5×109 ・L-1 ，各取40μL细胞悬液加入两个小玻璃管内，再加抗HBsAg或抗HCcAg的抗体和1∶20稀释的正常兔血清50μL，4℃30min;用DPBS洗涤2次，1000r・min-1 离心5min，弃上清，加入1∶10稀释的羊抗鼠荧光标记物50μL和1/104 的伊文蓝2μL，4℃30min;同上离心洗涤，加100μL固定液，制片后在荧光显微镜下观察.转染pcDNA3.1的阴性细胞对照检测方法同上.
2 结果
2.1 G418最适浓度和最佳电传孔条件 600和500mg・L-1 孔于第2日，400和300mg・L-1 孔于第3日，200mg・L-1 于第5日开始分别出现抑制现象，细胞开始溶解.其中300mg・L-1 和400mg・L-1 两孔培养细胞分别在第18日和第16日全部死亡，为克隆筛选的最适G418浓度.p815细胞经电穿孔后，过夜后观察活细胞计数，80%细胞死亡的电传条件为950μF，230V和17.0ms，为最佳电传孔参数.
2.2 G418筛选结果 G418筛选转染的p815细胞，3wk后细胞开始稳定生长，不再有细胞死亡.ELISA检测细胞培养上清，HBsAg和HCcAg均为阴性;免疫荧光法检测，HBsAg和HCcAg均只有约50%的细胞为阳性.
2.3 转染后阳性表达的RT┐PCR鉴定 G418筛选 后，逆转录再PCR扩增，HBV S片段与HBV S+HCV C片段均为阳性，两片段各约为670bp和1240bp，扩增的大小正确（Fig1，2）.
2.4 有限稀释法筛选的阳性克隆鉴定 G418结合有限稀释法再筛选后，免疫荧光检测，6孔中有两孔HBsAg和HCcAg的表达水平较高（Fig3，4），转染pcDNA3.1的细胞对照无论用抗HBsAg还是抗HCcAg作为一抗，免疫荧光检测均为阴性，Fig5为抗HCcAg作为一抗.
3 讨论
目前HBV与HCV都没有合适的细胞与动物感染模型，因此要建立HBV与HCV抗原特异性的靶抗原，只能借助体外转染技术.国内外学者先后有将HBV S基因或HCV C基因单独转染细胞的报道［5］ ，但应用较为局限.我们将含HBV S和HCV C基因的融合真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法导入p815细胞，经G418筛选，有限稀释法再筛选，获得了融合表达HBsAg/HCcAg的细胞克隆.该转染细胞系不仅可以作为HBV S基因或HCV C基因免疫后的CTL杀伤实验的靶细胞，而且同时可以作为HBVS与HCV C融合基因免疫后的CTL杀伤实验的靶细胞，从而可用于检测融合基因免疫动物后效应细胞对靶细胞的累加杀伤效果.
图3 －图5 略
载体的性质和电穿孔条件是影响转染效率的重要因素.pcDNA3.1载体为商品化的真核表达载体，在体外培养的细胞中可进行稳定表达，其所含CMV早期启动子/增强子，是经体外实验证实的最强的真核启动子之一，可使外源基因在哺乳动物细胞中高效表达;同时CMV诱导的表达缺乏明显的组织特异性，表达水平不会严格受限于细胞类型.pcDNA3.1载体还含有G418抗性的编码基因，其表达产物可分解G418，因此长期选择压力作用下可得到抗性克隆［6-8］ .电穿孔时，电压太小和（或）持续时间太短，转染效率不高;电压太大和（或）持续时间太长，则电击后细胞不能成活.实验中发现，p815细胞的最适电传条件为950μF，230V和17.0ms.转染质粒是闭环、超螺旋还是线性化转染效率高，说法不一.我们参照电传孔转染方法说明书，把重组质粒CSpcD-NA3.1用建议的BglⅡ酶切，使之线性化，转染细胞经G418筛选3wk后，细胞不再有死亡，RT-PCR检测HBV S与HCV C基因的转录，均为阳性，免疫荧光检测转染细胞有50%左右为阳性，其原因可能是有的细胞只表达了G418而未表达HBsAg/HCcAg.有限稀释后再筛选，得到了免疫荧光检测均为阳性的细胞克隆.实验中一抗标记物为异硫氰酸荧光素（FITC），激发后可产生绿色荧光，因此阳性细胞克隆镜下显示为绿色;为了增加荧光亮度，实验中加入伊文蓝作背景，因此阴性对照为桔红色.总之，G418筛选与有限稀释筛选相结合，是建立稳定转染细胞系的有效方法.
参考文献:
［1］Bertoletti A，Maini MK.Protection or damage:A dual role for the virus-specific cytotoxic T lymphocyte response in hepatitis B and C infection ［J］.Curr Opin Microbiol，2000;3（4）:387-392.
［2］Bohm W，Kuhrober A，Pair T.DNA vector constructs that prime hepatitis B surface antigen specific cytotoxic T lymphocyte and antibody responses in mice after intramuscular injection ［J］.J Immunol Methods，1996;193（1）:29-40.
［3］Encke J，Putlitz J，Wands JR.DNA vaccines ［J］.Intervirolo-gy，1999;42（2-3）:117-124.
［4］Yin W，Xu ZK，Xue XP.Construction of chimeric DNA vaccine and humoral immune responses to HBV and HCV ［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2001;17（3）:234-236.
［5］Geissler M，Katsutosh T，Takaji W.Differential cellular and humoral immune responses to HCV core and HBV envelope pro-teins after genetic immunizations using chimeric constructs ［J］.Vaccine，1998;16（8）:857-867.
［6］Guo SP，Wang WL，Zhai YQ.Construction and expression of eukaryotic expression vector of HBV x gene and its effect on the maligant phenotype of hepatocellur carcinoma cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（13）:1161-1165.
［7］Liu F，Zhang X，Cao WD，Zhang JN，Wang ZX.Effect of ex-ogenous p16/CDKN2gene on the cell cycle and proliferation of SHG-44glioma cell line ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:294-296.
［8］Si XH，Yang LJ，Jin Y.Establishment and identification of sta-bly-expression human bone marphogenetic protein2fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（2）:127-129. 转贴于