作者：王胜春，胡咏武，李剑锋，蒋永培
【关键词】 五灵胶囊
关键词: 五灵胶囊;免疫性;溶血素类;肝/损伤
摘 要:目的 观察五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响. 方法 小鼠免疫器官质量法观察五灵胶囊对免疫器官质量的影响;溶血素测定法观察体液免疫功能;E花结与脾抗体生成细胞试验观察细胞免疫功能;以LPS+BCG诱导小鼠免疫性肝损伤观察五灵胶囊对一氧化氮（NO）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）的影响;戊巴比妥钠诱导小鼠P450 观察五灵胶囊对小鼠P450 含量和睡眠时间的影响. 结果 五灵胶囊能使免疫小鼠E花结数、脾脏指数、胸腺指数和QHS增加，促进体内IgG与IgM释放，血清HCIgG 与HCIgm 水平上升.对免疫性肝损伤小鼠微粒体内NO五灵胶囊大剂量有促进作用，小剂量有抑制作用，对IL-2与IL-6影响不显著.戊巴比妥钠能诱导小鼠的P450 含量增加，五灵胶囊并不影响P450 含量，但却抑制P450 对戊巴比妥钠的代谢，使睡眠时间延长.此外，五灵胶囊还能降低戊巴比妥钠诱导升高的谷胱苷肽S转移酶（GSH-ST）. 结论 五灵胶囊是一种免疫增强剂，对体液免疫与细胞免疫均有促进作用，不诱导P450 产生，但能抑制P450 对戊巴比妥钠的代谢，对LPS诱导的细胞因子，五灵胶囊作用不显著，对微粒体内NO呈双向作用.
Keywords:Wuling capsule;immunity;hemolysins;liver/in-juries
Abstract:AIM To investigate the effect of Wuling capsule on immune function of mice.METHODS The influence of Wuling capsule on the weighty immune organ was observed by the method of immune organ weighty，the function of hu-moral immune by detection of hemolysin，and the impact of cell mediate immune by both test rosette formation and quan-titative haemolysis of SRBC（QHS）.After immunological liver injury in mice induced by micro lipopoly saccharide（LPS）and bacilli calmette Guein（BCG），the content of IL-2and IL-6，and the content of nitric oxide（NO）of hepatic mi-crosomes，were measured.The content P450 of hepatic micro-somes and sleep time of the mice were detected by injection of sodium pentobarbital.RESULTS Wuling capsule was an immunity excitation reagent，which could increase the index organ of spleen and thyme，the rosette formation，and elevat-ed the level HcIgG and HcIgM .The big dosage of Wuling cap-sule promoted and small dosage inhibited the action on NO of hepatic microsomes，and it did not exert much effect on IL-2and IL-6of mice immune liver injuries induced by LPS，wul-ing capsule didn’t add to the content of P450for hepatic mi-crosome but prolonged sleep time in pentobarbital mice，and it could reduce the glutasthine-s-transferase（GSH-ST）in mice induced by pentobarbital as well.CONCLUSION Wul-ing capsules are an immunity enhancer，which promote cellu-lar and humoral immunity without，increasing P450of hepat-ic microsomes.They have no effects on liver cytokine induced by LPS，and have double action on NO of hepatic micro-somes.
0 引言
复方中药五灵胶囊具有疏肝健脾和活血的功能，治疗慢性肝炎有较好的疗效［1］ .以往研究表明，五灵胶囊对化学性与免疫性慢性肝损伤有良好的治疗效果［2，3］ .为了探讨五灵胶囊对慢性肝损伤的机制，我们观察了五灵胶囊对小鼠免疫功能的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 五灵胶囊，由博爱制药有限责任公司提供（批号:970510，981206，991116）;小牛血清（Gibco产品）;2-巯基乙醇，由天津化学试剂厂生产（批号:910708）;一氧化氮（NO）、谷光苷肽S转移酶（GSH-ST）测试盒由南京建成生物工程研究所提供;脂多糖（LPS），Sigma公司产品;IL-2、IL-6测试盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供;卡介苗（BCG）由卫生部成都生物制品研究所提供，用时取1支（10人份），用溶剂2mL溶解作为供试品液;756紫外分光光度仪上海第三分析仪器厂生产.空白对照为蒸馏水，氢化泼尼松（prednisolone，PDS），上海第九制药厂生产（批号:920311）;环磷酰胺，连云港恒瑞制药有限公司提供，批号（981225）;BALB/c雄性小白鼠60只，体质量（20±2）g，豚鼠、绵羊红细胞、鸡红细胞（由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号陕医动证字08～013号）.
1.2 方法
1.2.1 免疫器官脏器指数测定 BALB/c小鼠60只，按体质量随机分为6组，即正常组、模型组、PDS组和五灵胶囊三剂量组（1，2，4g・kg-1 ），小鼠置室温（22±3）℃，湿度45%～65%的实验室适应环境3d后试验.试验之日正常组、模型组小鼠ig给予生理盐水20mL・kg-1 ，五灵胶囊组小鼠分别ig给予五灵胶囊1，2，4g・kg-1 ;PDS组SC，PDS25mg・kg-1 ，隔日1次;同日除正常组外，其余5组小鼠分别ip50mol・L-1 绵羊红细胞（SRBC）0.5mL，免疫3d重复1次.各组每日给药1次，连续给药7d;末次给药后小鼠禁食给水，次日小鼠眼眶取血，活杀取脾、胸腺称质量，结果以脾和胸腺指数表示（脏器指数=脏器质量/体质量×1000）.
1.2.2 玫瑰E花结与QHS测定 取以［1.2.1］实验组小鼠脾脏加Gsy’s缓冲液碾匀，稀释至8×109 ・L-1 的细胞悬液，按文献［4］方法，显微镜下计数玫瑰E花结形成数;取稀释为5×109 ・L-1 细胞数的脾细胞悬液0.5mL，依次加2g・L-1 SRBC和1∶10豚鼠血清各0.5mL，混匀，另设不加补体的对照管，置37℃水中温浴1h，450g离心5min，取上清液在A413nm 处测定A值，SRBC定量溶血值（QHS）［4］ 依溶血素测定法计算含量.
1.2.3 HcIgG 与HcIgM 的测定 取［1.2.1］实验组小鼠血清各10μL，1份不作处理，1份加等量2-巯基乙醇，置37℃水中温浴30min，两份血清各加Gsy’s缓冲液至4mL.取2-巯基乙醇处理的血清稀释液0.5mL，加50g・L-1 SRBC0.5mL，充分混匀，再加羊抗小鼠IgG和补体各0.5mL;空白管以0.5mL Gsy’s缓冲液代替血清同法操作;取未处理血清稀释液0.5mL，依次加入SRBC、补体、Gsy’S缓冲液各0.5mL同法操作;3样品置37℃水中温浴1h，450g离心10min，取上清液在A540nm 处测定A值.按文献［4］计算含量HcIgG =2-巯基乙醇处理血清的A值×稀释倍数，HcIgM =未处理血清的A值×稀释倍数.
1.2.4 IL-2与IL-6的测定 BALB/c雄性小鼠50 只，体质量（20±2）g，按体质量随机分成5组，正常组、模型组、环磷酰胺组和五灵胶囊1，0.5g・kg-1 组;小鼠置室温（22±3）℃、湿度45%～65%的实验室适应环境3d后试验，试验日正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL，余组小鼠尾iv BCG0.1mL，BCG注射6d后正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL，试验组小鼠尾iv LPS90μg，次日正常组小鼠腋窝SC生理盐水0.1mL，试验组小鼠注射完全佐剂0.1mL，同时正常组和模型组ig生理盐水10mL・kg-1 ，环磷酰胺组ip环磷酰胺30mg・kg-1 ，五灵胶囊组分别ig五灵胶囊1.0g・kg-1 和0.5g・kg-1 .给药6d，正常组ip生理盐水0.1mL，试验组ip LPS100μg，继续给药至12d，末次给药后，正常组小鼠尾iv生理盐水0.1mL，试验组小鼠尾iv LPS120μg，禁食给水，12h后活杀取肝组织用冰冷生理盐水冲洗，加TMS缓冲液置冰浴中匀化制得20g・L-1 肝匀浆，按文献［5］制备微粒体，4℃12216g离心30min，取上清3mL，加88mmol・L-1 氯化钙0.3mL，充分摇匀，4℃静置15min，12216g离心40min，弃上清，沉淀加0.3mol・L-1 磷酸缓冲液1mL碾匀作为微粒体供试品液.取供试品液0.5mL按硝酸还原酶法测定NO含量.在无菌状态下取小鼠脾脏碾磨，用1640完全培养液制成1×109 ・L-1 的悬液，加入24孔培养板，每孔1mL，再加ConA使其终浓度为5mg・L-1 ，置37℃50.0mL・L
-1 CO2 孵箱中培养48，72h，按文献［6］分别检测IL-2，IL-6的含量.
1.2.5 睡眠时间与P450 的测定 BALB/c雄性小鼠40只，体质量（20±2）g，按体质量随机分为4组，正常组、对照组和五灵胶囊1，2g・kg
-1 组;小鼠置室温（22±3）℃、湿度45%～65%的实验室适应环境3d后试验，试验日先分别ig五灵胶囊1，2g・kg-1 ，给药2h后，正常组ip生理盐水10mL・kg-1 ，其余3组ip50mL・L-1 戊巴比妥钠溶液10mL・kg-1 ，并观察记录小鼠的睡眠时间.连续重复试验3次，3d后小鼠禁食给水，12h后解剖取肝组织，用冰冷生理盐水冲洗，准确称取0.8g，加入冰冷的TMS（pH7.46）缓冲液制成200g・L-1 肝匀浆，4℃放置5min，12216g离心40min，沉淀加0.3mol・L-1 磷酸缓冲液1mL碾匀，按文献［5］测定P450 ，GSH-ST.统计学处理:方差分析，数据以x ±s表示.
2 结果
2.1 对SRBC诱导小鼠E花结、脾和胸腺脏器指数的影响 模型组小鼠被SRBC刺激后脾细胞E花结形成数、脾与胸腺脏器指数与正常组小鼠大致相似，PDS组脾与胸腺脏器指数显著低于模型组，与模型组比较差异显著（P&<0.01），E花结形成数与模型组相似.五灵胶囊三剂量组E花结数量显著高于模型组，脾脏器指数略高于模型组，但无统计学意义;1g・kg-1 组胸腺指数明显高于模型组（P&<0.05），2和4g・kg-1 组则与模型组相似（Tab1）.
2.2 对小鼠特异性免疫应答反应的影响 小鼠注射SRBC后，血清IgG与IgM水平显著升高，QHS亦显著增加，与正常组相比较差异显著（P&<0.01）;PDS对QHS有明显抑制作用.五灵胶囊1g・kg-1 能增加QHS，2和4g・kg-1 组对QHS作用与模型组相似，五灵胶囊三剂量组均能促进体内IgG与IgM的释放，使血清HcIgG 与HcIgM 水平上升，PDS能显著对抗SRBC对小鼠体内QHS、HcIgG 与HcIgM 的影响，使QHS、HcIgG 与HcIgM 值显著降低（Tab2）.
表2 五灵胶囊对小鼠血清溶血素HcIgG ，HcIgM 的影响 略
2.3 对小鼠免疫性肝损伤NO，IL┐2，IL┐6的影响 LPS诱导肝损伤小鼠微粒体内NO显著降低，脾细胞分泌IL-2下降与IL-6显著增加.环磷酰胺对肝损伤小鼠脾细胞分泌IL-2作用与正常组相近，对LPS 诱导肝损伤小鼠脾细胞升高的IL-6有明显抑制作用，对微粒体内NO的影响与模型组相似呈抑制作用.五灵胶囊两组对LPS诱导的肝损伤小鼠脾细胞分泌IL-2与正常组相近，但并不降低LPS诱导小鼠脾细胞升高的IL-6，对微粒体内NO的作用五灵胶囊1g・kg-1 组明显高于模型组，而五灵胶囊0.5g・kg-1 组对微粒体内NO的影响显著低于模型组（Tab3）.
表3 五灵胶囊对小鼠免疫性肝损伤NO及IL-2，IL-6的影响 略
2.4 对戊巴比妥钠诱导小鼠P450 、GSH┐ST的影响 戊巴比妥钠能诱导小鼠肝微粒体P450 增加，且随测定时间延长其值逐渐降低.五灵胶囊小剂量对戊巴比妥钠诱导小鼠肝微粒体内P450 含量无影响，而大剂量能降低P450 含量，但无显著性差异.戊巴比妥钠可使小鼠GSH-ST显著增加（P&<0.01），五灵胶囊组GSH-ST值与正常组相似，显著低于对照组（P&<0.01）（Tab4），五灵胶囊能延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间，与戊巴比妥钠组比较差异显著，且有剂量相关性（r=0.968，P&<0.01，Tab5）.
表4 五灵胶囊对戊巴比妥钠诱导小鼠P450 及GSH-ST催化活性的影响 略
表5 五灵胶囊对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响 略
3 讨论
五灵胶囊能加强SRBC所致E花结显著升高，脾脏指数增大，小剂量组使胸腺指数显著增大，大剂量则无明显影响，而PDS对SRBC诱导小鼠的E花结、胸腺指数均有显著性抑制作用.结果显示，五灵胶囊对小鼠的细胞免疫有增强作用.小鼠注射SR-BC后，其QHS，HcIgG ，HcIgM 较正常组小鼠显著增加，五灵胶囊小剂量有促进SRBC增强脾抗体生成细胞分泌抗体，而大剂量则有抑制作用.HcIgG 与HcgM 溶血素表明，五灵胶囊两剂量均有增强SRBC刺激机体分泌IgG与IgM的作用，且与剂量相关（r=0.97，P&<0.05）.结果提示，五灵胶囊对体液免疫有促进作用.在小鼠免疫性肝损伤模型中，细胞因子介导并参与肝损伤，五灵胶囊对微粒体内NO存在双向作用，大剂量呈促进作用，小剂量呈抑制作用.NO是体内信息分子，参与体内免疫炎症反应，它导致内毒素、TNF，IL-1，IL-6等细胞因子的病理作用.五灵胶囊大剂量组促进微粒体内NO增加，免疫抑制剂环磷酰胺对微粒体的NO则呈现抑制，这种内源性NO有利于细胞器代谢加强，使受损的细胞恢复常态.同时它促进血管扩张，加强组织的血液灌注，有益于代谢产物的排泄，但这又有加重炎症反应不利的一面.NO可介导IL-6、TNF等细胞因子的病理性损伤.LPS 促进脾细胞分泌IL-6，降低IL-2，提示LPS诱导的肝损伤与激活的枯否细胞释放过多的炎性介质如TNF，IL-1及IL-6有关［7］ ，五灵胶囊并不降低LPS诱导升高的IL-6，环磷酰胺有降低作用但无显著差异，提示五灵胶囊治疗慢性肝炎的作用并非是抑制吞噬细胞系统释放细胞因子所致，而是抑制部分细胞因子介导并参与肝损伤.戊巴比妥钠诱导小鼠微粒体内P450 含量显著增加，同时伴有GSH-ST增加，五灵胶囊大剂量对戊巴比妥钠诱导微粒体内P450 有降低作用，小剂量则无影响，能加强戊巴比妥钠的作用，使小鼠睡眠时间延长.大剂量组P450 含量下降，睡眠时间也更为延长.
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