作者：刘芳 陈必良 苏明权 王德堂
【关键词】 不育
关键词: 不育，男（雄）性;Y染色体;染色体缺失;基因
摘 要:目的 探讨Y染色体微缺失与原因不明性无精症、少精症所致男性不育的相关性. 方法 特发性少精症18例、特发性严重少精症12例、特发性无精症5例及正常已生育健康男性10例作为研究对象和正常对照.应用多重PCR技术，对精液基因组DNA进行Y染色体上连续的18个序列标记位点检测. 结果 少精症18例中发现Y染色体微缺失2例，严重少精症12例中发现Y染色体微缺失3例.无精症5例和正常已生育男性10例均末发现Y染色体微缺失.缺失形式3种. 结论 Y染色体微缺失与精子发生障碍相关.
Keywords:infertility，male;Y chromosome;chromosome deletion;genes
Abstract:AIM To evaluate the microdeletion of Y chromo-some in infertile men with idiopathic azoospermia and oligo┐zoospermia.METHODS 18patients with idiopathic a-zoospermia，12with severe idiopathic oligozoospermia and5with idiopathic oligozoospermia were selected for analysis.10normal fertile males were used as the control.Multiple poly-merase chain reaction was performed to detect microdeletin of Y chromosome in genomic DNA of semen，and a series of18sequencetagged sites（STSs）mapped within Y chromosome were selected.RESULTS Y chromosome microdeletion was observed in2of the18males with oligozoospermia，and in3 of the12males with severe oligozoospermia.No such dele-tion was observed in5azoospermic males and10normal fer-tile men.The3patterns of microdeletion were identified.CONCLUSION Y chromosome microdeletion might be closely related to spermatogenic failure.
0 引言
全世界约15%的夫妇不育，男性不育占50%左右，其中60%以上精子发生减少的原因不清，认为有遗传变异存在［1］ .近来发现Y染色体微缺失，主要是AZF基因缺失与之有关.我们采用多重PCR技术，对45例研究对象精液基因组DNA进行Y染色体微缺失检测，旨在从分子水平对男性不育病因作一些探索.
1 对象和方法
1.1 对象 2001-03/2001-11西京医院妇产科不孕不育专科门诊患者35例.其中特发性少精症18例，特发性严重少精症12例，特发性无精症5例.平均年龄33（26～39）岁，婚后不育年限1.5～8（平均3.5）a.所有患者性功能正常，无生殖系统器质性病变及炎症、阻塞等.10例正常对照精液标本为西京医院妇产科实验室储存，平均年龄27.5（22～35）岁.所有研究对象在检测前抽静脉血检查染色体核型（G显带技术）、抗精子抗体（ELISA）及血清激素水平（卵泡刺激素、黄体激素、睾酮，放射免疫测定法），异常者均不列入研究对象.
1.2 方法 精子密度判断根据1992年WHO标准制定，采用北京伟力经贸公司WLKY-9000伟力彩色精子质量检测系统进行检测.研究对象禁性生活3d后，取精液检查，连续2次异常予以确诊.无精症:精液中未见精子;严重少精症:精子密度小于5×109 ・L-1 ;少精症:精子密度（5～20）×109 ・L-1 .精液基因组DNA提取采取氛氯仿抽提法.精液标本离心弃上清，生理盐水洗涤后，加入细胞稀释悬浮液、10g・L-1 SDS，3mol・L
-1 氯化钠、双蒸水和酚氯仿（V∶V∶V∶25∶24∶1），离心取上层，加无水乙醇离心，75mL・L-1 乙醇洗涤，双蒸水溶解DNA.紫外分光光度计及20g・L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度及含量.提取的DNA置-20℃保存.缺失筛查采用美国Promega公司生产的Y染色体缺失检测系统（Y chromosome Deletion Detection System，Versisn1.1Part#TM234），其包含有Y染色体上与精子生成基因最相关的18个已知序列标记位点引物对.同时扩增18个非多态序列标记位点短DNA片段（分别位于AZFa AZFb AZFc AZFd区域，Fig1）.扩增产物长度为83～370bp，琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察.试剂盒提供对照梯度标准物.
2 结果
35例异常精液标本除5例无精子症外，余30例少精症中28例伴有精子活率低下，精子活率范围3.0%～46.6%，平均25.3%.10例对照男性其精子数量及活率正常.所有精液标本采用氛氯仿抽提法提出了精液基因组DNA，经多重PCR扩增，电泳显示特异性SMCX带（83bp），示多重PCR扩增反应有效，提取的DNA具有完整性.35例患者精液基因组DNA经多重PCR扩增检测后发现5例有Y染色体微缺失，缺失率14.3%，其中2例为少精症，3例为严重少精症.5例无精症患者和10例对照男性未发现Y染色体微缺失.缺失表现形式3种:1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFb（SY130+SY128）缺失;1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFd（SY152）缺失;余3例均为AZFc缺失（Fig1，Tab1）.5例缺失患者均有AZFc缺失，无AZFa缺失，亦无AZFb和AZFd单独缺失.AZFc缺失片段各不相同，但包含有共同缺失片段DAZ（SY254，SY255，Fig1，2）.
图1 略
表1 Y染色体微缺失患者缺失部位、片段及精子密度、活率 略
3 讨论
我们发现35例不明原因性无、少精症患者中有5例显示Y染色体微缺失，10例正常对照无一例发现微缺失，提示Y染色体微缺失与男性精子发生相关.Y染色体微缺失发生率报道不一［2，3］ .Foresta等［4］ 分析不育男性4800例Y染色体基因微缺失，发现无精症男性缺失率最高，其次是严重少精症和少精症.我们的结果只发现严重少精症缺失率高于少精症，5例无精症患者无一例发现微缺失，与无精症患者样本量少可能有关.我们研究表明，缺失最多的部位亦为AZFc区中的DAZ基因，且所有DAZ基因缺失患者均有共同缺失片段:DAZ基因簇中的SY255和SY254，提示此两基因参与精子的发生.
图2 略
关于Y染色体微缺失的机制说法不一，主要认为:①Y染色体在精子发生过程中，由于胚细胞快速分裂，与卵子发生过程相比具有更多突变机会;②Y染色体不能象常染色体一样进行DNA修复;③所有Y染色体基因都是单倍体，故一个基因缺失就能发生效应［3］ .但也有学者持相反观点:认为Y染色体微缺失形成是一种随机事件，不依赖于Y染色体出现的背景，可能是其它遗传或环境因素所致，Y染色体微缺失是导致男性无、少精症的重要原因.
参考文献
［1］Krausz C，McElreavey K.Y chromosome and male infertility ［J］.Front Biosci，1999;15（4）:l-8.
［2］Maurer B，Gromoll J，Simoni M，Nieschlag E.Prevalence of Y chromosome microdeletions in infertile men who consulted a ter-tiary care medical centre:The Munsteer experience ［J］.An-drologia，2001;33（1）:27-33.
［3］Hiroshi Kato，Shinji Komori，Yuko Nakata.Screening for dele-tions in interval D16～22of the Y chromosome in azoospermic and oligozoospermic Japanese men ［J］.Hum Genet，2001;46（3）:110-114.
［4］Foresta C，Moro E，Ferlin A.Y chromosome microdeletions and alteration of spermatogenesis ［J］.Endocr Rev，2001;22（2）:226-239.转贴于