关于IL┐2促进C6胶质瘤细胞增殖及IL┐2R在该细胞的表达

作者：周华　朱运龙　钟延清　王高峰　王薇　胡玉珍　韦耿泽

【关键词】 神经胶质瘤
　　关键词: 白细胞介素2;神经胶质瘤;细胞分裂;受体，白细胞介素2;信号传递
　　
　　摘 要:目的 观察IL-2对C6大鼠星形神经胶质瘤细胞增殖的影响，并从蛋白及mRNA水平观察白细胞介素-2受体（IL-2R）α，β，γ3条链在C6神经胶质瘤细胞中的表达. 方法 应用细胞培养、MTT法、3 H-TdR掺入法、免疫细胞化学方法和RT-PCR技术. 结果 ①IL-2（1×104 ～1×106 U・L-1 ）可显著促进C6细胞的增殖;②C6细胞中检测到IL-2R的β、γ2条链的免疫反应阳性物质;③IL-2Rβ，γmRNA在C6细胞中均有表达. 结论 IL-2可显著促进C6神经胶质瘤细胞的增殖，C6细胞表达IL-2Rβ、γ2条链的蛋白与mRNA，可能介导IL-2增殖信号的传递，从而初步证实IL-2可直接作用于神经胶质细胞并进一步阐明了IL-2增殖信号的转导机制，为揭示细胞因子在神经系统中的普遍作用机制提供更多证据.
　　
　　Keywords:interleukin-2;glioma;cell pision;receptors in-terleukin-2;signal transduction
　　
　　Abstract:AIM To investigate the effects of interleukin-2（IL-2）on the proliferation of C6glioma cell line and the ex-pressions ofα，β，γchains of interleukin-2receptor（IL-2R）in the cell line at protein and mRNA levels.METHODS Techniques used in this experiment included cell culture，MTT，3 H-TdR incorporation，immunocytochemistry and RT-PCR.RESULTS ①IL-2significantly increased the prolifer-ation rates of C6cells;②IL-2Rβ，γ-immunoreactive produc-tion was detected in C6cells;③Il-2Rβand IL-2RγmRNA were both expressed in the cells.CONCLUSION IL-2could stimulate the proliferation of C6cell line，also the protein and mRNA of IL-2Rβ，γwere expressed in the cells.All of them can provide more evidence for the direct action of IL-2in glioma cells and further disclose the cytokin’s role in the cen-tral nervous system.
　　
　　0 引言
　　
　　白细胞介素-2（IL-2）是T细胞产生的一种免疫因子.神经免疫内分泌调节网络研究的多项结果显示IL-2是该网络共享信息分子.IL-2对神经系统功能具有重要的调节作用.星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种细胞，对维持神经系统的功能发挥至关重要的作用，以往研究表明IL-2能够影响其他胶质细胞的增殖活动［1］ .IL-2对靶细胞的作用通过IL-2受体（IL-2R）蛋白介导.IL-2R由α，β，γ3条链组成［2］ ，其中β，γ两条链是介导IL-2信号转导尤其是增殖信号转导的关键环节［3，4］ .IL-2R在神经系统中有广泛表达［5］ .本实验旨在初步探讨IL-2对星形胶质瘤细胞增殖的影响并从蛋白和基因水平研究IL-2R在C6胶质瘤的表达状况.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 C6大鼠神经胶质瘤细胞系（第四军医大学病理学教研室），DMEM培养基、Trizol（Gibco），新生小牛血清（Hyclone），EDTA，MTT（华美公司），兔抗大鼠IL-2Rα，β，γ抗体（Santa Cruz），ABC试剂盒、DAB（Sigma），反转录试剂盒、PCR反应试剂盒（Promega），PCR扩增仪（Jencons），3 H-TdR（上海原子核研究所），LS-6500液闪计数仪（Beckman），ZT-Ⅲ型细胞收集仪（绍兴卫星机械公司）.
　　
　　1.2 C6细胞培养 细胞培养于含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养基中，置于50mL・L-1 CO2 ，37℃孵箱中.传代时以0.2g・L-1 EDTA消化3～5min，离心（1000r・min-1 ，5min），培养液悬浮，接种于培养瓶.
　　
　　1.3 MTT法 以2×108 ～5×108 ・L-1 细胞数接种细胞于96孔培养板，共分4组（每组5孔），孵箱中培养24h后，换为无血清培养基培养，再向每组分别加入1×103 ，1×104 ，1×105 ，1×106 U・L-1 的IL-2，空白对照组仅加无血清培养液，孵箱中培养48h后，每孔加入5g・L-1 MTT20μL继续培养4h，弃去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡10min，用酶联免疫分析仪测A490nm 值.
　　
　　1.4 3 H┐TdR掺入法 细胞接种与加IL-2处理步骤同MTT法，加IL-28h后，每孔加入3.7×104 Bq3 H-TdR继续培养40h，细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干，移入加有500μL闪烁液的测量瓶内，液闪计数仪进行掺入量测定，其值以Bq表示.
　　1.5 免疫细胞化学染色 细胞传代时调整细胞数至4×107 ～5×107 ・L-1 ，滴加于预先置于24孔板内的1cm2 小盖片上（包被有多聚赖氨酸），置于孵箱中，待细胞贴壁后每孔加500μL培养液，继续培养48h，随后取出以40g・L-1 多聚甲醛固定（4℃，25min），行常规ABC染色，一抗为兔抗大鼠IL-2Rα，β，γ抗体（1∶1000），DAB呈色.以正常羊血清（1∶50）取代一抗为阴性对照.
　　1.6 RT┐PCR反应
　　
　　1.6.1 总RNA的提取 将细胞接种于90mm2 培养皿，培养3d后，取出培养皿，加入1mL冰预冷Trizol，待细胞大部分漂浮，移入1.5mL离心管中，室温静置5min，加入0.2mL氯仿摇匀，室温下静置15min，4℃12000g离心15min，移上清于新离心管中，加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min，4℃12000g离心10min，弃上清，750mL・L-1 乙醇洗一次，将RNA沉淀晾干，用20μL无RNA酶水55℃溶解10min，-20℃保存待用.
　　
　　1.6.2 cDNA的合成 20μL的cDNA合成反应体系（提取的总RNA5μL，25mmol・L-1 ，MgCl2 4μL，10×反转录缓冲液2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶1.5μL，引物1μL，无RNA酶水补至20μL），42℃水浴60min，沸水浴5min灭活反转录酶4℃，5min使酶与DNA分离.
　　1.6.3 PCR反应 取4个0.5mL离心管各加入合成的cDNA模板1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，4×NTP混合物2μL，再分别加入β-actin引物（sense:5’-TTGTAACCAACTGGGA CGATATG-G-3’;antisense:5’-GATCTTGATCTTCATGGT-GCTAGG-3’）、IL-2Rα引物（sense:5’-TGAATGC-AAGAGAGGTTTCCG-3’;antisense:5’-CTC TG-TAGAGCCTTGTATCCT-3’）、IL-2Rβ引物（sense:5’-GCCAGCTGCTTCACCAACCA-3’;antisense:5’-GAGAAGAGCAGCAGGTCATC-3’）、IL-2Rγ引物（sense:5’-GAGTACATGAATTGCACTTGG-3’;antisense:5’-TCTAGC TGGGATTCACTC-AG-3’）（以上引物均由赛百盛生物公司合成）各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，去离子水补至25μL，首次循环为94℃4min，中间循环为94℃1min，62℃1min，72℃1min，循环35次.
　　
　　统计学处理:组间用origin5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理.3 H-TdR掺入实验中将实验组所得值转换为对照组Bq均数百分数.实验所得数据均以x ±s表示.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 IL┐2对C6细胞增殖的影响 1×104 ，1×105 ，1×106 U・L-1 的IL-2可提高C6细胞A490nm 值（Tab1）.以3 H-TdR掺入率反映细胞增殖能力，1×104 ，1×105 ，1×106 U・L-1 的IL-2可显著提高C6细胞
3 H-TdR掺入率（Fig1）. 　　图1 略
　　
　　2.2 IL┐2Rα，β，γ链在C6细胞的表达 C6细胞中存在IL-2Rβ与γ2条链的免疫反应阳性物质，均位于胞质，未检测到α链免疫反应阳性物质（Fig2）.
　　表1 IL-2对C6细胞MTT A490nm 值的影响　略
　　
　　图2 略
　　
　　2.3 IL┐2Rα，β，γmRNA在C6细胞的表达 凝胶电泳结果显示于220～240bp与200bp左右处出现特异条带，其分别对应β，γ链PCR产物，与所设计引物间的片段大小基本相符合，未检测到α链PCR产物（Fig3）.
　　
　　图3 略
　　
　　3 讨论
　　
　　以往研究证明IL-2不仅在免疫系统内有重要作 用，同时也参与调节神经系统的生理功能，如它能影响寡突胶质细胞的增殖［1］ ，可提高神经元和神经胶质细胞的存活率，发挥神经营养作用［6］ ，它还可诱导培养人胶质母细胞瘤的增殖［7］ 等.在较低浓度条件下，IL-2能够释放生长信号，并通过IL-2R传递此信号［4］ .在本研究中我们发现1×104 ～1×106 U・L-1 IL-2可显著促进C6细胞的增殖，发挥类生长因子作用.为进一步揭示IL-2该细胞促增殖的机制，我们又检测了IL-2R在C6细胞的表达，IL-2Rβ，IL-2Rγ两条链在蛋白水平和mRNA水平都有表达，而未检测到α链.
　　IL-2的作用是通过IL-2R蛋白的介导.IL-2R是生长因子膜受体中唯一由α，β，γ3种不同的膜成分组成的受体，这3条不同的链以多种组合形式构成亲和力相异的IL-2R，IL-2与仅表达α链的细胞结合不引起任何生物学应答，而单独的β或γ链也并不能结合IL-2，只有具有较强亲和力的IL-2R（αβγ链）或中亲和力的IL-2R（βγ链）才是IL-2内化或信号转导尤其是增殖信号转导所必须［3，4，8，9］ .由此可见β，γ链的存在以及二者的结合是IL-2R发挥其作用的关键环节.IL-2Rβ是具有WSXWS特征的受体家族成员之一，其在胞质区存在两个结构域:一个靠近膜端的丝氨酸结合区，此区在IL-2所诱导的增殖信号传递过程起重要作用，另一个是与酪氨酸激酶相联酸性区域;IL-2Rγ也是WSXWS家族成员之一，其胞质区部分氨基酸序同源于src同源区2（Sh3），此区能与一些磷酸化蛋白中磷酸化酪氨酸残基相连从而参与信号转导［3，10］ .与其他生长因子受体不同，IL-2R的胞质区缺乏酪氨酸蛋白激酶（PTK）功能区，但IL-2能激活包括p56（lck）在内的非受体酪氨酸激酶src家族PTK活性，其中Jak1和Jak3以非共价键与IL-2Rβ，γ链相联从而快速诱导包括二者在内的胞内蛋白磷酸化，启动c-myc和其他与细胞增殖周期密切相关基因的表达［8，9，11］ .以往有研究证实IL-2与脑部肿瘤的发生过程有一定的联系［12］ .已有报道，低浓度IL-2作用于靶细胞时，首先迅速与IL-2Rα结合，这有利于其与IL-2Rβ、γ链的结合［4］ ，由此可见α链并非IL-2增殖信号转导所必须，而是IL-2R增强其信号捕获能力的重要成分.本实验中，较高浓度IL-2（1×106 U・L-1 ）依然能够促进细胞增殖而不引起毒性伤害，可能与C6细胞表面缺失IL-2Rα而降低IL-2与IL-2R的有效结合能力，弱化了IL-2信号的传入有关.
　　本研究初步从细胞增殖角度探讨了IL-2对C6神经胶质瘤的作用，以及IL-2R在该细胞的表达状况，从而为进一步揭示细胞因子在神经系统中的普遍作用机制及其调控神经系统肿瘤发生提供更多的实验依据.
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