作者：付建芳 姬秋和 黄威权 张南雁
【关键词】 肿瘤坏死因子
关键词: 脱噬作用;肿瘤坏死因子;配体;受体，甲状腺炎，自身免疫性
摘 要:目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其死亡受体（DR4，DR5）在桥本甲状腺炎发病机制及病理改变中的作用及意义. 方法 采用免疫组织化学方法和图像分析，检测18例桥本甲状腺炎患者甲状腺标本中TRAIL，DR4和DR5的表达及分布. 结果 桥本甲状腺炎组甲状腺滤泡细胞TRAIL，DR4和DR5免疫反应产物的相对含量分别为（0.095±0.018），（0.080±0.020），（0.084±0.015）;结节性甲状腺肿组甲状腺滤泡细胞TRAIL、DR4和DR5免疫反应产物的相对含量分别为（0.045±0.014），（0.041±0.020），（0.042±0.016）.桥本甲状腺炎组以上3种免疫反应产物的相对含量均显著高于结节性甲状腺肿组（P&<0.05）.桥本甲状腺炎病理改变越重，甲状腺滤泡细胞TRAIL，DR4和DR5免疫染色越强;浸润淋巴细胞中TRAIL，DR4和DR5免疫染色较弱或呈阴性. 结论 TRAIL，DR4和DR5在桥本甲状腺炎中的甲状腺滤泡呈特征性分布的高表达，病理改变越重，表达越强;提示甲状腺滤泡细胞通过自身表达TRAIL，DR4和DR5，以细胞凋亡形式破坏甲状腺滤泡细胞.
Keywords:apoptosis;tumor necrosis factor;ligands;recep-tors;thyroiditis，autoimmune
Abstract:AIM To investigate the significence of the ex-pression of TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL），death receptor4（DR4）and death receptor5（DR5）in the pathogenesis and pathological changes in Hashimoto’s thy-roiditis（HT）.METHODS Expressions and distributions of TRAIL，DR4and DR5in thyroid tissues from18patients with HT were investigated by immunohistochemical and in situ quantification methods.RESULTS The relative amounts of positive immunostaining for TRAIL，DR4and DR5in thyrocytes from HT and NTG patients were（0.095±0.018）and（0.045±0.014），（0.080±0.020）and（0.041±0.020），（0.084±0.015）and（0.042±0.016），respectively.The relative amounts of positive immunostaining for TRAIL，DR4and DR5in thyrocytes from HT patients were siginifi-cantly greater than those from the nontoxic goiter（NTG）pa-tients（P&<0.05）.Strongly positive immunostained thyro-cytes of HT for TRAIL，DR4and DR5were mainly distribut-ed in follicles adjancent to lymphocytic infiltrates.Staining of infiltrating lymphocytes for TRAIL，DR4and DR5was found to be rather weak or even negative.CONCLUSION High characteristic expressions of TRAIL，DR4and DR5in thyro-cytes from HT were observed.The immunostaining of infil-trating lymphocytes for TRAIL，DR4and DR5was rather weak or negative.Expressions of TRAIL，DR4and DR5by thyrocytes in HT may lead to their destruction through apop-tosis.
0 引言
桥本甲状腺炎（HT）是器官特异性自身免疫性疾病，以甲状腺组织中大量淋巴细胞浸润和甲状腺滤泡细胞破坏为特征，其发病机制尚不清楚.近年的研究表明细胞凋亡在HT的发病机制中起重要作用［1，2］ ，尤其对凋亡分子FasL、Fas的研究中发现其在HT病理改变中起重要作用
［3］ .肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是新发现的凋亡分子，在许多组织中存在，与其两个死亡受体DR4（TRAILR1），DR5（TRAILR2）相互作用，诱导许多组织来源的肿瘤细胞株迅速凋亡.TRAIL的另两个诱捕受体DcR1（TRAILR3）缺乏死亡功能区，DcR2（TRAILR4）胞内区只含有死亡功能区的1/3，因而不能介导凋亡，但可以抑制DR4，DR5介导的凋亡［4］ .有实验［5］ 证实活性T淋巴细胞表达TRAIL并对其诱导的细胞凋亡敏感.因此推测TRAIL及其受体在维持免疫系统对自身抗原的免疫耐受和组织自身稳定中起重要作用.而HT中有较多的甲状腺滤泡细胞发生凋亡，且多发生在浸润淋巴滤泡附近［1，2，6］ .对于TRAIL在HT中是否表达尚未见报道，本实验旨在观察HT中TRAIL及其死亡受体的表达和分布，以探讨其在HT中发病机制和病理改变中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 取1996/2000在西京医院普通外科活检及手术并经病理诊断为HT的18例甲状腺标本;对照组非毒性甲状腺肿（NTG）18例，所有病例均未经药物治疗.所有标本经40g・L-1 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5μm连续切片，贴于预先涂有APES的载玻片上，37℃烤箱36h，鼠抗人TRAIL，DR4和DR5单克隆抗体由第四军医大学免疫学教研室惠赠.SABC试剂盒购自华美生物工程公司，DAB购自Sigma公司.
1.2 方法 ①组织切片经二甲苯、纯乙醇常规脱蜡至水.②用30mL・L-1 甲醇-双氧水室温作用30min，以封闭内源性过氧化物酶.③滴加1∶200稀释的小鼠抗TRAIL，DR4和DR5单克隆抗体于4℃过夜.④加1∶100的生物素标记的抗小鼠IgG抗体室温孵育2h.⑤加1∶50的ABC复合物室温孵育1h.以上各步骤之间均用0.01mL・L-1 PBS（pH7.3）洗10min×3次.⑥用DAB显色液（含DAB5.0mg，0.01mL・L-1 PBS40mL和300mL・L-1 双氧水40μL）显色30min.⑦脱水、透明及DPX封片.⑧结果观察及记录.采用OLYM-PUS BH-2光学显微镜观察并摄片.免疫阳性产物为棕黄色，以正常羊血清及PBS代替一抗染色，作为阴性和空白对照.密封片号情况下，用LE-ICAQ500MC图像分析系统对染色强度进行定量分析，每张切片随机抽取10个视野，选择合适的门限分割值，测定阳性细胞的平均灰度值，计算单位面积免疫阳性产物的相对含量.
统计学处理:采用SAS软件对所测的灰度值进 行t检验，方差不齐行t’检验，P&<0.05为相差显著.
2 结果
2.1 TRAIL免疫组织化学染色 TRAIL免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，位于NTG和HT甲状腺滤泡细胞的胞质内.NTG组中TRAIL免疫染色阳性细胞多分布在小滤泡上，滤泡结构完整.阳性细胞为低柱状，也有扁平状.胶质中有一些脱落细胞呈染色阳性.HT组的甲状腺滤泡细胞TRAIL免疫染色增强，分布不均匀，强阳性细胞多集中分布在浸润淋巴滤泡附近的甲状腺滤泡上，部分滤泡已萎缩、破坏，失去滤泡结构，滤泡内无胶质;另一部分滤泡结构完整，强阳性细胞多为立方状或低柱状，HT中浸润淋巴细胞TRAIL染色较弱或不染色（Fig1）.
2.2 DR4，DR5免疫组织化学染色 两组甲状腺滤泡细胞均有阳性物质，位于细胞膜和细胞质内.NTG组中DR4，DR5免疫阳性的甲状腺滤泡细胞散在分布，阳性细胞呈低柱状，少数为扁平状.HT组中DR4、DR5阳性的甲状腺滤泡细胞分布不均匀，染色阳性细胞多集中分布于浸润淋巴滤泡附近，且多在小滤泡上，呈立方状或低柱状，可见部分滤泡萎缩.HT中浸润淋巴细胞DR4，DR5染色较弱或不染色（Fig2，3）.
2.3 TRAIL，DR4，DR5免疫反应产物的相对含量 HT组的3种免疫反应产物的相对含量均显著高于NTG组（P&<0.05，Tab1）.
表1 TRAIL，DR4和DR5免疫反应产物的相对含量 略
3 讨论
TRAIL是肿瘤坏死因子/神经生长因子（TNF/NGF）超家族成员，TRAIL可以与其4个不同的受体结合，这些受体包括死亡受体DR4（TRAILR1），DR5（TRAILR2），诱捕受体DcR1（TRAILR3，TRID），DcR2（TRAILR4，TRUNDD）.TRAIL不像FasL，只表达于免疫细胞［7］ 和几个免疫特赦位点［8-10］ ，许多组织都表达TRAIL的mRNA［11］ .TRAIL和它的死亡受体DR4和/或DR5相互作用，迅速诱导许多组织来源的肿瘤细胞株发生凋亡.DcR1缺少胞内区（死亡功能区），DcR2胞内区仅含有死亡功能区的1/3，故不能介导凋亡，但可抑制DR4，DR5介导的凋亡.Jeremias等
图1 － 图3 略
Bretz等［13］ 研究表明，细胞因子IFN-γ，IL-1β和TNF-α可使正常甲状腺滤泡细胞TRAIL表达上调.Ajian等［14］ 报道，在桥本甲状腺炎组织标本中，CD8+ 和CD4+ T淋巴细胞表达IFN-γ，IL-1β和TNF-α等细胞因子.因此推测桥本甲状腺炎的浸润淋巴细胞通过分泌细胞因子，使其附近的甲状腺滤泡细胞表达高水平的TRAIL，DR4和DR5，从而使甲状腺滤泡细胞发生凋亡.这与我们研究所显示的桥本甲状腺炎中TRAIL，DR4，DR5高表达，并且TRAIL，DR4，DR5阳性的甲状腺滤泡细胞多分布在淋巴滤泡附近相吻合.另外甲状腺滤泡细胞自身也可诱导表达功能性的TRAIL，杀伤淋巴样细胞.因此Bretz等［13］ 提出甲状腺滤泡细胞破坏的机制之一，即炎症因子诱导表达TRAIL的甲状腺滤泡细胞通过杀伤表达细胞因子的入侵淋巴细胞，使得甲状腺滤泡细胞逃避免疫攻击.当发生桥本甲状腺炎时CD8+ 和CD4+ T淋巴细胞大量表达IFN-γ，IL-1β和TNF-α等细胞因子，使甲状腺滤泡细胞TRAIL表达上调，通过自分泌或旁分泌方式，与甲状腺滤泡细胞上的DR4，DR5结合，从而诱导甲状腺滤泡细胞发生凋亡.我们的结果支持了以上观点.
参考文献
［1］Kotani T，Aratake Y，Hirai K，Fukazawa Y.Apoptosis in thy-roid tissue from patients with Hashimoto’s thyroiditis ［J］.Au-toimmunity，1995;20（4）:231-236.
［2］Tanimoto C，Hirakawa S，Kawasaki H，Hayakawa N，Ota Z.Apoptosis in thyroid disease:A histochemical study ［J］.Endocr J，1995;42（2）:193-201.
［3］Giordano C，Stassi G，De Maria R，Todaro M.Potential involv-ment of Fas and its ligand in the pathogenesis of Hashimoto’s thyroiditis ［J］.Science，1997;275:960-963.
［4］Pan G，Ni G，Wei YF，Ni J，Yu G.An antagonist decoy recep-tor and a death domain-containing receptor for TRAIL ［J］.Sci-ence，1997;277:815-818.
［5］Jeremias I，Herr I，Boehler T，Debatin KM.TRAIL/Apo-2-lig-and-induced apoptosis in T cells ［J］.Eur J Immunol，1998;28:143-152.
［6］Hammond LJ，Lowdell MW，Cerrano PG，Goode AW.Analy-sis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto’s thyroiditis ［J］.J Pathol，1997;182（2）:138-144.
［7］Suda T，Takahashi T，Golstein P，Myc A，Ain KB.Molecular cloning and expression of the Fas ligand，a novel member of the tumor necrosis factor family ［J］.Cell，1993;75:1169-1178.
［8］Runic R，Lockwood C，LaChapelle L，Mclntosh RS.Apoptosis and Fas expression in human fetal membranes ［J］.J Clin En-docrinol Metab，1998;83:660-666.
［9］Griffith T，Brunner T，Fletcher S.Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilige ［J］.Science，1995;270:1189-1192.
［10］Bellgrau D，Gold D，Selawry H.A role of CD95ligand in pre-venting graft rejection ［J］.Nature，1995;377:630-632.
［11］Pitti R，Masters S，Ruppert S，Donahue CJ.Induction of apop-tosis by Apo-2ligand，a new member of the tumor necrosis fac-tor cytokine family ［J］.J Biol Chem，1996;271:12687-12690.
［12］Zhang YP，Ji QH，Zhang WH，Zhang NY.Fas and FasL ex-pression in Hashimoto’s thyroiditis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xue-bao（J Fourth Mil Med Univ），2000;（2）:223-225.
［13］Bretz J，Rymaszewski M，Arscott P.TRAIL death pathway ex-pression and induction in thyroid follicular cells ［J］.J Biol Chem，1999;274（33）:23627-23632.
［14］Ajian RA，Waston PF，Mclntosh.Intrathyroidal cytokine gene expression in Hashimoto’s thyroiditid ［J］.Clin Exp Immunol，1996;105（3）:523-528.转贴于