作者：赵宁 张英起 王增禄 刘昌孝 陈拯民 顾以保 蔡永明 高连用 李全胜 曾勇
【关键词】 肿瘤坏死因子α
关键词: 肿瘤坏死因子α;药代动力学;放射测量术;HPLC;ELISA
摘 要:目的 为探讨新型重组人肿瘤坏死因子（nrTNFα）药代动力学而建立生物样品中nrhTNFα的检测方法. 方法 ①方法Ⅰ（RA）:动物肌注125 Ⅰ标记的nrhTNFα后，测定各生物样品中的总放射活性;②方法Ⅱ（HPLC-RA）:上述生物样品先经HPLC分离后，收集并测定其中125 Ⅰ-nrhTNFα部分的放射活性;③方法ⅢEILISA法. 结果 RA，HPLC-RA法检测的nrhTNFα质量浓度与放射性呈直线相关（RA，r=0.999HPLC-RA，r=0.999）.ELISA法证明rhTNFα的酶联免疫检测药盒适用于nrhTNFα的检测，rhTNFα的标准曲线与nrhTNFα的标准曲线显正相关，r=0.994.这一检测系统与其他细胞因子包括IFNα，TNFβ，IL-2和IL-6无交叉反应. 结论 RA，HPLC-RA和ELISA法均可作为nrhTNFα的药代动力学实验方法.
Keywords:tumor necrosis factor-alpha;pharrmacokinetics;radiometry;HPLC;ELISA
Abstract:AIM To establish three methods of detecting nrh-TNFαin biological samples for investigating the pharma-cokinetics of nrhTNFα.METHODS Method I（RA）:Mea-suring the total radioactivity in biological samples after125 Ⅰ-nrhTNFαadministration by im injection to animals.MethodⅡ（HPLC-RA）:Collecting and measuring the radio activity of125 Ⅰ-nrhTNFαafter samples separated by HPLC.MethodⅢ:ELISA.RESULTS The mass concentrations of nrhTNFαmeasured by RA and HPLC-RA had straight line correlation with their radioactivity.It was demonstrated that the rhTNFαELISA kit was suitable for nrhTNFαdetection and both standard curves of rhTNFαand nrhTNFαhad a good positive correlation with a correlation coefficient of0.994.The ELISA system showed no cross reaction with any other cytokines including IFNα，TNFβ，IL-2and IL-6.CON┐CLUSION Three methods（RA，HPLC-RA，and ELISA）established for detecting nrhTNFαin biological sampis could be used as pharmacokinetic methods of nthTNFα.
0 引言
肿瘤坏死因子（TNF）是当代的研究热点［1-10］ .实验方法对药代动力学研究是至关重要的.测定方法的特异性、灵敏度和准确性是研究的基础，对于基因工程表达的多肽类药物更是如此，因为它不但受体内大量物质的干扰，而且由于药物剂量很小（μg），体内浓度又极低，这就加大了测定的难度.为了对新型肿瘤坏死因子进行药代动力学研究，我们参考文献方法［11-14］建立了相应的药代动力学实验方法.
1 材料和方法
1.1 材料 新型重组人肿瘤坏死因子（简称nrhT-NF）由第四军医大学生物技术中心提供，纯度经GFC-HPLC分析鉴定纯度为97.5%;昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22g，由天津药物研究院动物室提供;仪器HPLC及Biosep SEC-S3000柱为美国Phenmenex公司产品;γ-计数器FT-630型为北京核仪器厂出品;450型酶标仪为美国Bio Rad公司产品;ELISA试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供.
1.2 方法
1.2.1 放射活性测定（RA）法 标准曲线的制备以1000μg・L-1 nrhTNFα标准液（0.05mol・L-1 磷酸缓冲液，7.40×108 Bq・L-1 的125 I-nrhTNF）配成质量浓度为0.02，0.1，0.5，4，20和100μg・L-1 的应用液，各取20μL置于测定管中，γ-计数器测定，将质量浓度与计数值（cpm）绘成标准曲线.按照标准曲线方法分别做血清、脑、脂肪、心、肌肉、肝、脾组织中125 I-nrhTNFα的校正曲线.
1.2.2 HPLC分离结合放射活性测定（HPLC-RA）法 标准曲线按RA法中标准曲线制备方法配制成应用液，各取10μL经SEC S3000柱在HPLC上分离，收集固定时间的洗脱液，置于测定管中，在γ-计数器上计数，将浓度与计数值（cpm）绘制成标准曲线.以同样方法制备血清中nrhTNFα的校正曲线，并测定质量浓度为0.5，4.0，20.0μg・L-1 时血清样品经HPLC分离后nrhTNFα的量，以计算回收率.
1.2.3 酶联免疫测定（ELISA）法 采用第四军医大学免疫学教研室rhTNFα试剂盒，以一株mAb包被96孔板，4℃过夜，样品和标准品均做复孔，每孔加样100μL.另一株mAb作酶标抗体，加TMB于37℃反应15min后以2mol・L-1 硫酸终止反应，在酶标仪上测定各孔的吸收度，检测波长为450nm，给药小鼠或正常对照小鼠眼眶取血，室温放置30min后于4000r・min-1 离心15min，分离出血清，立即加入甲基氟磺酸至1mmol・L-1 ，-20℃保存，当天样品24h内测定完毕.以0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600μg・L-1 nrhTNFα做血清中nrhTNFα的标准曲线.
2 结果
采用Iodoge法进行标记的125 I-nrhTNFα经sephacryl S-200HR柱纯化后放射活性浓度为14.80×108 Bq・L-1 ，放射比活性为15.90×108 Bq・L-1 ，放射化学纯度在95%以上.
2.1 RA法 标准曲线和校正曲线表明，nrhTNFα质量浓度与cpm呈直线相关，标准曲线方程为Y=8.4+533X（r=0.999），血清、脑、脂肪、心、肌肉、肝和脾组织的校正曲线方程分别为:Y=7.5+513X（r=0.999，血清）、Y=8.2+688X（r=0.994，脑）、Y=5.0+653X（r=0.999，脂肪）、Y=12.3+618X （r=0.999，脾）、Y=14.5+651X（r=0.996，肌肉）、Y=0.5+671X（r=0.995，肝）、Y=12.3+618X（r=0.999，心）.从血清中直接测定nrhTNF的回收率（Tab1），其批内和批间测定精密度良好（Tab2），变异系数（CV%）符合实验要求，检测灵敏度为0.01μg・L-1 .
表1 血清中125 I-nrhTNFα的回收率 略
表2 血清中125 I-nrhTNFα测定精密度 略
2.2 HPLC┐RA法 标准曲线和校正曲线显示，质量浓度与cpm值呈直线相关.标准曲线方程为Y=13.5+642X（r=0.999），血清校正曲线方程为Y=7.1+720X（r=0.999）.该法回收率较好（Tab1），在0.5～20μg・L-1 范围内其回收率均在95%以上，批内和批间测定精密度（CV%）均符合实验要求（Tab2），检测灵敏度为0.02μg・L-1 .
2.3 ELISA法 用rh-TNFα的ELISA药盒可以测定血清中nrh-TNFα的含量.用该药盒制备的rh-TNFα标准曲线二者呈正相关，相关系数为0.994，当血清中nrh-TNFα浓度范围在0.025～1.600ng时其浓度的对数（lgc）与显色后的吸光度值（A）呈直线相关，校正曲线方程为lgc=1.372+1.022A（r=0.996）.本法的最低检测浓度为0.025μg・L-1 .nrh-TNFα的质量浓度为0.1，0.50和1.00μg・L-1 时的批内变异系数均小于2.33%，血清中nrhTNFα质量浓度为0.05，0.50和1.00μg・L-1 时的回收率均大于72%.本法具有较高的特异性，与IFNα，IFNβ，IL-2和IL-6等其他细胞因子均无交叉反应.
3 讨论
对于药代动力学研究，被试药物的检测方法是至关重要的，不但要求检测方法可靠、灵敏、重复性好，而且要求特异性强，往往单一方法不完全具备这些特点，而采用几种方法联合应用，以达到药代动力学的要求.我们建立的RA法，其检测灵敏度、精密度良好，但其专一性较差，因为它测定的是总放射活性，除了125 I-nrhTNFα外，还包括125 I-nrhTNFα降解产物，甚至脱落的同位素，即总放射活性不能完全代表原型（未降解）药物.只有将色谱方法与同位素法相结合，将带同位素的药物（125 I-nrhTNFα）和非药物分离后，才能测得真实的原型药物浓度，使实验方法的灵敏性和准确性得以提高，增加实验结果的可靠性，所以我们选用了HPLC-RA法，但该法较复杂，测定周期长，需要贵重仪器，特别是测定大量样品时问题更为突出.而ELISA法更能可靠反映原型药物的特异性.但其检测灵敏度明显逊于前两种方法.总之，RA、HPLC-RA和ELISA3种方法均可用于检测生物样品（血清）中rnhTNFα的含量，做为药代动力学研究，除了RA法外就能反映原型药变化的HPLC-RA和ELISA法相互印证为好.
致 谢 我校免疫学教研室金伯泉教授、刘雪松、李琦和杨琨同志给予的大力支持和帮助.
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