紫杉醇和顺铂诱导下的凋亡卵巢癌细胞对树突细胞提呈功能影响

　　　　作者：冯勤梅， 吴霞， 王颖， 葛海良， 狄文

【摘要】 　　目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡后能否具有较强的免疫原性， 并可以被抗原提呈细胞交叉提呈并促进免疫应答。方法: 用巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4（IL4）刺激人外周血单核细胞分化诱导为树突状细胞（DC）， 6 d后将DC和经紫杉醇联合顺铂在体外诱导发生凋亡的人卵巢癌细胞株共同培养， 并以冻融细胞共培养DC组和单独DC组作对照， 共培养4 h后， 进行激光扫描共聚焦显微镜观察DC细胞对凋亡细胞的吞噬作用， 同时以流式细胞术(FCM)检测不同培养组DC的分化和成熟程度。结果: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DC有效吞噬， 与对照组相比， 凋亡组DCs的表达及成熟度均明显增高， 并具有统计学意义（P﹤0.05）。结论: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性， 可以促进DC的分化和成熟。

【关键词】 紫杉醇; 顺铂; 树突状细胞; 细胞凋亡; 抗原提呈

　　［Abstract］ AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation， DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P&<0.05). CONCLUSION: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin exhibit strong immunogenicity， which in turn promote the maturation and antigen presentation of DCs.

　　［Keywords］paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation

　　化疗药物通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞， 而凋亡的肿瘤细胞是否具有免疫原性一直是倍受争议的话题， 近来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能否有效激发免疫应答， 与肿瘤细胞的性质和化疗药物有关［1］。本研究旨在探索紫杉醇联合顺铂化疗药物诱导卵巢癌细胞凋亡后的免疫原性， 探讨诱导凋亡的肿瘤细胞能否被树突状细胞（dendritic cell， DC）交叉提呈， 从而促进免疫应答， 为临床制定合理的化疗联合免疫疗法治疗肿瘤提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 紫杉醇、 顺铂购自山东齐鲁制药厂; 淋巴细胞分离液购自上海化学试剂厂; 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor， GMCSF)、 白介素4（interleukin4， IL4）、 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα， TNFα）均购自R&&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活细胞探针购自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗体CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a单克隆抗体(mAb)购自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料购自深圳晶美公司; RPMI1640培养液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910细胞株为上海市免疫学研究所馈赠; 人浓缩白细胞由自愿者提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人外周血细胞定向诱导分化和培养DC 取60 mL浓缩WBC， PBS稀释至200 mL， 采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心分离获取外周血单个核细胞， PBS洗涤细胞2次， 细胞计数， 在6孔板中以无血清RPMI1640培养液悬浮细胞至密度为5×109/L， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱2 h后取出， 洗去悬浮细胞（收集备用）， 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培养液诱导培养贴壁细胞， 第3天半量换液， 第6天收集悬浮细胞， 计数。

　　1.2.2 HO8910凋亡细胞的制备 将HO8910细胞按紫杉醇和顺铂不同的作用剂量和不同时间分组处理， 紫杉醇顺铂浓度分别为2.5～0.3 mg/L、 25～3 mg/L、 125～15 mg/L、 250～30 mg/L， 分别作用12 h、 24 h和36 h后， 用2.5 g/L胰酶消化贴壁细胞， 将细胞用PBS重悬至1×109/L， 取100 μL， 以药物未处理组为空白对照， 参照Annexin VPI试剂盒说明书检测各组细胞的凋亡率。

　　1.2.3 HO8910冻融抗原制备 收获HO8910细胞， 用PBS重悬至2×1010/L， 置液氮内10 min， 取出后速投入37℃水浴溶解， 反复5次。以3 000 r/min离心10 min， 收集上清， -80℃保存备用。

　　1.2.4 DC与凋亡细胞激光共聚焦扫描 消化对数增长期HO8910细胞株， 以PBS 重悬细胞至1×109/L， 加入CFSE终浓度为25 μmol/L， 50 mL/L CO2、 37℃培养箱共孵育30 min， RPMI1640培养液洗涤细胞1次后， 用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640液重悬细胞， 并铺板培养。次日加入紫杉醇和顺铂（浓度为250～30 mg/L）， 培养24 h（此条件为1.2.2步骤实验得出诱导细胞凋亡的最佳浓度和时间）后取出， 收集悬浮细胞， 计数。凋亡细胞与培养6 d后的DC以1∶1比例共孵育， 以未处理细胞为对照， 按相同比例和DC共培养， 4 h后取出， 用PBS洗涤细胞， 加入小鼠抗人PECD83抗体， 共孵育30 min后， 用PBS洗涤细胞， 并用40 g/L多聚甲醛固定悬浮细胞， 置于细胞甩片机中1 000 r/min离心3 min， 将细胞固定于载玻片上， 500 mL/L甘油PBS封片， 激光共聚焦显微镜检测。

　　1.2.5 不同类型肿瘤抗原负载DC表面标志的检测 DC培养至6 d， PBS冲洗收获所有的DC， 分为3组进行实验: 空白组， 单纯DC组; 冻融组: HO8910冻融抗原负载DC组; 凋亡组: 紫杉醇顺铂诱导HO8910凋亡细胞负载DC组。共培养4 h后洗涤细胞， 用100 mL/L FBS1640悬浮细胞， 并加入TNFα至100 μg/L， 培养24 h后流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表达。

　　1.2.6 统计学分析 计量资料以x±s表示， 采用SPSS11.5数据包方差分析， P&<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 紫杉醇顺铂诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡最佳时间与剂量的选择 为确定紫杉醇和顺铂联合诱导人卵巢癌细胞株HO8910的最佳作用剂量和最适作用时间， 我们选取了4个作用浓度和3个作用时间点（见前）处理HO8910细胞， 结果显示紫杉醇顺铂作用浓度为125～15 mg/L， 作用时间12 h后细胞凋亡开始明显增加， 以250～30 mg/L浓度作用24 h细胞基本完全凋亡。显微镜下可见作用24 h后， 细胞呈悬浮状， 部分细胞胞膜不完整。作用36 h后FCM检测结果显示细胞大多呈坏死状态， 显微镜下观察发现细胞呈碎片。上述结果表明， 紫杉醇和顺铂联合诱导HO8910细胞凋亡时， 浓度250～30 mg/L， 作用24 h为凋亡最适剂量、 最佳时间点效应（图1）。

　　图1 紫杉醇/顺铂作用不同浓度与不同时间细胞的凋亡比例（略）

　　Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points

　　a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.

　　2.2 外周血单核细胞来源的DC的体外诱导 经常规贴壁法获得外周血单核细胞后， 采用通用的GMCSF和IL4条件培养基体外诱导分化DC， 培养3 d后， 在倒置光学显微镜下观察可见细胞开始呈集簇生长， 部分细胞的细胞膜有突起， 培养至第6天， 可见大部分细胞悬浮生长， 胞体大且外形不规则， 细胞膜呈树突状突起， 胞质丰富， 并具有典型DC形态（图2）， 表明细胞已向DC分化， 可用于进一步表型分析和功能检测。

　　图2 倒置显微镜下DC的形态特征（略）

　　Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)

　　2.3 诱导DC细胞的表型检测 外周血来源的单核细胞经GMCSF和IL4诱导培养6 d后， 获得未成熟的DC细胞， 采用单独TNFα作用、 TNFα﹢冻融细胞和TNFα﹢凋亡细胞培养24 h后， FCM检测DC表面标志的表达。结果显示条件培养第6天较培养前CD14的表达明显下降， CD1a、 CD80、 CD86的表达上调， CD83的表达为10%左右（图3）。培养7 d后单独TNFα作用和TNFα+冻融细胞作用后CD83表达约35%左右， 两者间无统计学意义（P&>0.05）， 但其在TNFα﹢凋亡细胞作用后表达上升为50%， 且与前两者间有统计学意义（P&<0.05）; 共刺激分子CD80/CD86的表达在单独TNFα作用和TNFα+冻融细胞作用后的DC细胞表面较诱导前明显上调， 但两组间无明显差异; 而经TNFα﹢凋亡细胞作用后的DC细胞表面CD80/CD86表达升高更为明显， 与两组对照组DC相比， 增高有统计学意义（P&<0.05， 表1）。

　　图3 诱导前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα诱导后细胞表面标志变化（略）

　　Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes， GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells

　　表1 不同肿瘤抗原刺激后DC表面标志的表达（略）

　　Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens

　　aP&<0.05 vs freeze thawing group.

　　2.4 凋亡细胞可以被DC细胞有效的吞噬 比较DC与凋亡的HO8910细胞和未处理HO8910细胞共培养后， DC对两类细胞的吞噬情况， 结果显示（图4）仅在凋亡组中可见DC膜与凋亡细胞融合、 DC细胞胞体内有凋亡小体、 小颗粒状溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡细胞的现象， 而DC对正常的HO8910无吞噬作用。进一步通过FCM检测DC吞噬凋亡细胞在时相上是否存在差异， 结果表明随共培养时间延长， DC的吞噬未见增加， 4 h与24 h之间无统计学意义。

　　图4 DC对凋亡肿瘤细胞、 未处理的肿瘤细胞吞噬的激光共聚焦扫描（略）

　　Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines

　　A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.

　　3 讨论
　　
　　卵巢癌死亡率极高， 减少卵巢癌复发、 提高预后的一个重要策略是在手术和化疗后再应用如免疫治疗、 分子靶向治疗和基因治疗等巩固疗法［2］。近年来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能够有效激发免疫应答［3］。如果能将卵巢癌免疫治疗与传统治疗方法合理联合将为卵巢癌的治疗开辟新的途径、 带来新的曙光。研究证明肿瘤免疫逃逸的机制不仅由于缺乏抗原， 而且与抗原不能被有效提呈给T细胞而不能产生特异性免疫应答有关［4］。因此肿瘤免疫治疗的一个巨大挑战是如何使抗原被有效提呈而激发有效的抗肿瘤免疫应答。如果化疗诱导的凋亡细胞具有免疫原性、 能被APCs提呈则是化疗联合免疫治疗的基础。
　　
　　Nowak等［5］学者发现二氟脱氧胞嘧啶核苷介导的凋亡细胞不是耐受原， 凋亡细胞能诱导DC成熟并激活相关的T细胞。另有学者发现化疗诱导的凋亡肿瘤细胞数目增加， 使得APCs吞噬作用加强， APCs被激活后释放更多的前炎性细胞因子， 从而促进APCs对肿瘤抗原的交叉提呈［6］。而Casares等［7］发现丝裂霉素C致凋亡的肿瘤细胞不具有免疫原性。上述研究结果提示， 不同肿瘤细胞经不同化疗药物作用后， 其免疫原性仍然存在不确定性。紫杉醇和铂类是目前国内外公认的卵巢癌一线化疗药物， 本实验中应用紫杉醇联合顺铂诱导卵巢癌细胞株凋亡后， 论证凋亡细胞对DC的影响。应用激光共聚焦显微镜发现与凋亡细胞共培养的DC胞内见吞噬凋亡小体， 且DC胞体中出现小颗粒状溶解碎片， 而DC对正常HO8910无吞噬作用。同时FCM检测发现与凋亡细胞共培养的DC， 其共刺激分子表达较空白组和冻融组显著升高， 因此相同数量凋亡肿瘤细胞的免疫原性强于冻融肿瘤抗原， 表明DC通过吞噬负载凋亡细胞后其成熟度的表达明显增加， 行使抗原提呈的功能显著增强。本实验结果证明紫杉醇+顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞并不隔离抗原， 相反使交叉提呈的肿瘤抗原性显著增加， 促进了DC的成熟与提呈作用。
　　
　　此外， 本研究中还有一个发现， 即冻融组在加冻融抗原前后， DC的共刺激分子表达无明显改变， DC未被冻融抗原活化。我们认为部分原因有可能是由于加入冻融抗原的效价过低， 但更可能是来源于HO8910的冻融肿瘤抗原本身不具有诱导异体DC活化的抗原表位， 但凋亡组加凋亡细胞后， DC的共刺激分子表达改变明显。本研究认为应用凋亡的细胞作为抗原可能不需要识别肿瘤特异性肽段和受MHC限制， 化疗诱导的凋亡细胞有望成为免疫治疗的自身抗原， 这些对于DC疫苗的制备及化疗联合免疫治疗提供了重要的信息。
　　
　　肿瘤的免疫治疗规范化是一个尚未解决的问题， 如何将免疫治疗与传统的化疗结合起来更是一个空白的领域。越来越多的研究认为化疗诱导的凋亡细胞促进免疫应答反应。因此如何将免疫治疗与化疗合理结合将是今后致力研究的课题， 本课题为此研究提供了重要理论依据。

参考文献

　　［1］ Correale P， Cusi MG， Del Vecchio MT， et al. Dendritic cellmediated crosspresentation of antigens derived from colon carcinoma cells exposed to a highly cytotoxic multidrug regimen with gemcitabine， oxaliplatin， 5fluorouracil， and leucovorin， elicits a powerful human antigenspecific CTL response with antitumor activity in vitro［J］. J Immunol， 2005， 175(2): 820-828.

　　［2］ Coukos G， ConejoGarcia JR， Ronder RB， et al. Immunotherapy for gynaecological malignancies［J］. Expert Opin Biol Ther， 2005， 5(9): 1193-1210.

　　［3］ Vari F， Hart DN. Loading DCs with Ag［J］. Cytotherapy， 2004， 6(2): 111-121.

　　［4］ Ward S， Casey D， Labarthe MC， et al. Immunotherapeutic potential of whole tumor cells［J］. Cancer Immunol Immunother， 2002， 51(5): 351-357.

　　［5］ Nowak AK， Lake RA， Marzo AL， et al. Induction of tumor cell apoptosis in vivo increases tumor antigen crosspresentation， crosspriming rather than crosstolerizing host tumorspecific CD8 T cells［J］. J Immunol， 2003， 170(10): 4905-4913.

　　［6］ Van der Most RG， Currie A， Robinson BW， et al. Cranking the immunologic engine with chemotherapy: using context to drive tumor antigen crosspresentation towards useful antitumor immunity［J］. Cancer Res， 2006， 66(2): 601-604.

　　［7］ Casares N， Pequignot MO， Tesniere A， et al. Caspasedependent immunogenicity of doxorubicininduced tumor cell death［J］. J Exp Med， 2005， 202(12): 1691-1701.