Autotaxin多克隆抗体的制备

　　　　　　作者：李颂， 姜望舒， 邱洋， 张俊杰

【摘要】 　　目的: 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Autotaxin（58157位氨基酸）融合蛋白， 制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法: 构建pET21cAutotaxin(58157)重组表达质粒， 转入BL21大肠杆菌， IPTG诱导蛋白表达， 经镍离子金属螯合树脂纯化后， 用纯化的蛋白免疫家兔， 制备抗Autotaxin的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价， Western blot检测抗体特异性， 并用于免疫组化实验。结果: 在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58157)His6融合蛋白， 经亲和纯化后免疫家兔， 获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论: 成功构建pET21cAutotaxin(58157)表达质粒， 原核表达获得高纯度的目的蛋白， 制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。

【关键词】 Autotaxin; 原核表达; 多克隆抗体

　　Autotaxin（ATX）是一个分泌型糖蛋白， 具有5核苷磷酸二酯酶（phosphodiesterase， PDE）活性， 是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ectonucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase， ENPPs）家族的一员［1］。 ATX还具有溶血磷脂酶D（lysoPLD）活性， 能够以溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidycholine， LPC）为底物催化生成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid， LPA）［2］。通过对ATX缺失杂合体小鼠和野生型小鼠的比较发现， ATX缺失杂合体小鼠血清中LPA的含量和ATX的活性均为野生型小鼠的一半。这一结果从整体上进一步表明ATX是体内催化产生LPA的重要物质［3］。LPA作为一种能够与Edg家族G蛋白偶联受体结合的脂类信号分子， 与肿瘤关系密切。它可以促进癌细胞增殖、 分化、 调节细胞间相互作用， 抑制细胞死亡， 提高细胞的运动性、 侵染性， 并促进细胞产生细胞因子［4］。
　　
　　ATX在很多肿瘤细胞中都有高表达， 在肿瘤的发生、 发展过程中有着重要作用， 被认为是肿瘤治疗中一个可能的靶位［5］。此外， ATX在神经系统［6］、 免疫系统［7］中也发挥重要作用。以往研究结果表明， ATX可以作为一些肿瘤的诊断、 预后标记。例如， 有研究发现ATX可以作为眼色素层黑素瘤患者预后状况的判断指标［8］; ATX含量在术后前列腺癌患者体内下降， 它可能成为前列腺癌的预后指标［9］。最近有研究发现在慢性丙肝患者的血清中ATX表达量显著上调， 认为ATX可能在肝癌的发生过程中起关键作用［10］。基于ATX在肿瘤发生、 发展中的重要作用， 对其表达调控机制的研究和抑制剂的开发成为研究热点。制备高效价、 高特异性的抗Autotaxin多抗将有助于与Autotaxin相关的理论和应用研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pET21c原核表达载体、 BL21大肠杆菌菌株由本实验室保存。人卵巢癌细胞株SKOV3由ATCC购买。SKOV3培养于含有100 U/mL青霉素（Invitrogen）、 100 U/mL链霉素（Invitrogen）， 2 mmol/L的L谷氨酰胺（Invitrogen）， 100 mL/L胎牛血清（Hyclone）的RPMI1640培养基（Gibco）中。培养于含50 mL/L CO2， 37℃的恒温培养箱中（Thermo）。异丙基β硫代半乳糖苷（IPTG）购自Merck公司; TRIzol购自Invitrogen公司; 反转录试剂盒购自Promega公司; 限制性内切酶、 Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司; NiNTA Resins购自Novagen公司; BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体购自中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pET21cAutotaxin(58157)原核表达质粒的构建 从高表达Autotaxin的人卵巢癌细胞系SKOV3中抽提细胞总RNA， 用Promega反转录试剂盒合成cDNA。PCR扩增Autotaxin蛋白58157位氨基酸对应的cDNA。PCR引物由上海生工生物技术公司合成， 序列如下: 上游引物5′GGAATTCATATGTCTTGCAAGGGCAGGTGC3′， 下游引物5′CCGCTCGAGGCATTCTGCGGCCTTTATTTC3′。PCR扩增条件为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸40 s（30个循环）; 72℃ 10 min。 选用Nde I、 Xho I酶切位点， 将PCR产物克隆入pET21c质粒， 转化BL21大肠杆菌菌株。

　　1.2.2 Autotaxin(58157)His6融合蛋白的诱导表达及纯化 将含有pET21cAutotaxin(58157)质粒的E.coli BL21菌株接种于LB培养液中， 培养至A600大约为0.6左右， 加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L诱导4 h。 6 000 r/min离心收集菌体。用裂解缓冲液（300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L磷酸盐缓冲液， 10 mmol/L咪唑， pH8.0）重悬， 冰上超声破碎菌体， 12 000 r/min离心30 min， 收集上清。上清与NiNTA Resins混合， 经漂洗缓冲液（300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L磷酸盐缓冲液， 20 mmol/L咪唑， pH8.0）洗涤， 洗脱缓冲液（300 mmol/L NaCl， 250 mmol/L磷酸盐缓冲液， 50 mmol/L咪唑， pH8.0）洗脱收集蛋白。纯化得到的蛋白经PBS 4℃透析过夜， BCA法定量。

　　1.2.3 免疫家兔 将纯化的Autotaxin(58157)His6融合蛋白与弗氏完全佐剂等量乳化后， 对家兔进行免疫。免疫6次后采集抗血清。

　　1.2.4 ELISA测定抗体效价 将纯化的Autotaxin(58157)His6稀释到20 mg/L， 50 μL/孔包被于96孔酶标板， 家兔免疫前血清作为阴性对照， 经过6次免疫的血清为阳性血清。通过ELISA方法检测抗体效价。

　　1.2.5 Western blot检测抗体特异度 构建表达全长Autotaxin的真核表达pcDNA4Autotaxin质粒， 转染HeLa细胞， 48 h后收集细胞培养上清， 进行Western blot检测。以制备的抗Autotaxin抗血清为一抗（1∶1 000稀释）， 羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体为二抗。用转染空载pcDNA4质粒的HeLa细胞培养上清作为阴性对照。

　　1.2.6 结直肠癌组织标本的免疫组化 选取Autotaxin高表达的结直肠癌组织标本（由第二炮兵总医院病理科提供）进行免疫组化。以制备的Autotaxin抗血清为一抗（1∶500稀释）， 羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体为二抗。用没有进行免疫的家兔血清作为阴性对照。

　　2 结果

　　2.1 Autotaxin 58157位氨基酸对应的cDNA的PCR扩增和克隆 从高表达Autotaxin的SKOV3细胞系中抽提总RNA， 逆转录获得出的cDNA。以cDNA为模板， PCR扩增Autotaxin蛋白58157位氨基酸对应的cDNA序列（300 bp）。结果表明扩增片段大小与预期值相符（图1）。选用Nde I、 Xho I酶切位点， 将PCR产物克隆入pET21c质粒， 并对重组质粒进行了双酶切鉴定（图1）和序列测定。

　　图1 Autotaxin(58157)His6原核表达质粒的构建（略）

　　1: DNA marker （DL 5 000）; 2: PCR产物; 3: pET21cAutotaxin(58157)质粒酶切鉴定.

　　2.2 Autotaxin(58157)His6融合蛋白的诱导表达及纯化 与未诱导的菌株相比， 转化了pET21cAutotaxin(58157)重组质粒的E.coli BL21菌株， 经过IPTG诱导在相对分子质量（Mr）11 000和17 000之间出现了1条明显的条带， 大小与Autotaxin(58157)His6的理论值13 000相符（图2）， 表明重组蛋白诱导表达成功。超声破碎后， SDSPAGE分析表明目的蛋白存在于上清中， 即目的蛋白可溶。经过亲和纯化， 将获得的目的蛋白进行SDSPAGE分析， 可见单一的条带， 证明蛋白纯化成功， 纯度达到90％以上（图2）。经过PBS透析后， 用BCA法测定蛋白浓度， 纯化蛋白浓度为2.7 g/L。

　　图2 Autotaxin(58157)His6蛋白的表达与纯化（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 未诱导的菌体蛋白; 2: 诱导后的菌体蛋白; 3: 超声破碎后的上清蛋白; 4: 杂蛋白洗脱液中的蛋白; 5: 空白洗脱缓冲液; 6: 亲和纯化的蛋白.

　　2.3 多克隆抗体的效价测定 将透析定量后的Autotaxin(58157)His6融合蛋白与弗氏完全佐剂等量乳化后， 对家兔进行免疫， 免疫6次后采集抗血清。将免疫6次后采集的抗血清作为阳性血清（P）， 以家兔免疫前血清作为阴性对照（N）， 用纯化的Autotaxin(58157)His6蛋白为抗原， 间接ELISA法测定多克隆抗体效价。以不加抗原的空白孔的吸光度校零后， 2倍于阴性对照吸光度值的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。如表1所示， 抗血清的效价达到125 000， 说明经过6次免疫， 家兔体内产生了高效价的抗体。

　　2.4 多克隆抗体特异性的测定 为了检测多克隆抗体是否可以特异性地检测到ATX蛋白， 用pcDNA4Autotaxin瞬时转染HeLa细胞， 分泌表达全长Autotaxin， 并以转染空载pcDNA4的HeLa细胞为阴性对照。制备的抗Autotaxin多克隆抗体在pcDNA4Autotaxin转染的HeLa细胞培养上清中可检测到大小为125 000的单一条带（图3）， 与Autotaxin的大小相符， 转染空载pcDNA4的阴性对照中则没用信号， 表明制备的多克隆抗体可以灵敏、 特异地检测细胞培养上清中的Autotaxin。

　　表1 抗Autotaxin多克隆抗体的效价检测（略）
　
　　2.5 多克隆抗体在免疫组化中的应用 选取结直肠癌组织标本进行免疫组化检测。与免疫前的阴性血清相比， 制备的抗Autotaxin多克隆抗体在结直肠癌组织标本中检测到较强的阳性信号（图4）， 证明我们制备的多克隆抗体可以用于免疫组化分析， 检测Autotaxin在组织中的分布与表达状况。

　　图3 抗Autotaxin多克隆抗体的特异性检测（略）

　　1: HeLa细胞瞬时转染pcDNA4Autotaxin真核表达质粒; 2: HeLa细胞瞬时转染pcDNA4空质粒.

　　图4 结直肠癌组织标本的免疫组化分析（略）

　　A: 抗Autotaxin多克隆抗体的检测; B: 免疫前血清的检测.

　　3 讨论
　　
　　我们将Autotaxin 58157位氨基酸对应的cDNA克隆进入了pET21c原核表达载体， 经过表达纯化， 获得了Autotaxin(58157)His6融合蛋白。以该蛋白为抗原， 通过免疫家兔获得了抗Autotaxin的多克隆抗体。经过检测， 我们制备的多克隆抗体具有高效价和特异度。
　　
　　多克隆抗体的优劣主要取决于效价和特异度两方面， 为了充分确保这两点， 在制备过程中我们主要注意了以下几方面的问题: 首先， 我们选用pET21c原核表达载体。pET系列的载体蛋白表达量较高， 6×His标签的融合表达便于抗原的纯化， 而且与GST、 Mal等标签相比， 6个组氨酸对于抗体的特异性不会造成太大影响， 有利于确保多抗的特异性。我们选用了一个其他的带6×His 标签的蛋白进行了ELISA实验， 结果表明我们的多抗对His的识别能力极弱。第二， 由于Autotaxin是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPPs）家族的一员， 在序列上与ENPP1和ENPP3具有较高的同源性［11］， 因此在抗原序列选择上我们经过仔细比对， 选取了靠近Autotaxin N端的100个氨基酸， 这段氨基酸序列具有较高的特异性， 进一步保证了抗体的特异性。第三， 利用pET系列载体纯化蛋白， 目的蛋白经常以包涵体形式存在于菌体沉淀。为了提高纯化效率， 减轻实验难度， 我们尽可能促使抗原可溶。在选取抗原肽段的时候， 我们考虑了氨基酸序列的特点， 选取的氨基酸序列中没有疏水残基较为集中的区域， 加之使用较低浓度的IPTG（0.2 mmol/L）进行诱导， 获得了可溶性的目的蛋白。
　　
　　大量的研究表明， ATX在肿瘤的发生、 发展过程中有着重要作用， 并被认为是肿瘤治疗中一个可能的靶位。最新研究发现， LPC18∶1和LPC18∶2的下降可以作为结直肠癌早期诊断的指标， 但LPC的下降是否与ATX的活性升高相关还有待证实。我们将以结直肠癌为研究对象， 对正常的结直肠组织、 肠道腺瘤组织以及结直肠癌组织中Autotaxin的分布和表达水平进行系统的免疫组化检测， 分析Autotaxin在结直肠癌发生和发展过程中的作用。高质量Autotaxin多抗的制备为我们进一步开展以Autotaxin为目标的肿瘤早期诊断、 肿瘤分子标记研究提供了有利的条件。

参考文献

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