RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达的研究

　　　　　　 作者：黄娅琳， 寇俊萍， 宋佳希， 余伯阳

【摘要】 　　目的: 构建人MYH9（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）的siRNA 表达体系， 抑制原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYH9 基因的表达。方法: 针对人MYH9 基因序列， 构建siRNA 表达质粒， 通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒pGCsiMYH91/2/3 至HUVEC 细胞， 通过半定量RTPCR 和蛋白质印迹， 分别检测在转染后24 h、 48 h、 72 h MYH9 在mRNA 转录水平及蛋白表达的变化。结果: 在构建的3种重组质粒中， pGCsiMYH92、 pGCsiMYH93在转染后24 h 均表现出一定的干扰作用， 转染后48 h干扰作用最强， 转染后72 h 干扰作用减弱; pGCsiMYH93的干扰作用最明显， 转染后48 h， 能明显下调HUVEC 的MYH9 蛋白表达， 抑制率平均可达71.2%， 此时MYH9 基因mRNA 转录明显减少， 抑制率为86.5%。结论: 在转染后48 h pGCsiMYH93 可明显抑制HUVEC 细胞内源MYH9 的表达， 为进一步研究MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。

　　AIM: To construct the expression vector of small hairpin RNA (shRNA) and to investigate its efficacy in silencing nonmuscle myosin heavy chain ⅡA (MYH9)gene. METHODS: According to the MYH9 cDNA sequence in GenBank， three shRNA expression vectors targeting MYH9 gene were constructed and were confirmed by digestion with restriction enzymes and DNA sequencing. The recombinant plasmids were transfected into HUVEC cells. The expression of MYH9 was determined by semiquantitative RTPCR at mRNA level and by western blotting at protein level at 24 h， 48 h and 72 h after transfection. RESULTS: The decrease of MYH9 expression at mRNA and protein levels gradually became more evident from 24 h to 48 h， and achieved the maximal degree at 48 h， then became weakened and restored at 72 h. The efficiency of pGCsiMYH93 was the best among these three plasmids. The introduction of pGCsiMYH93 was showed to efficiently and specifically inhibit the expression of MYH9 with inhibitory rate at 71.2% according to results of Western blot. RTPCR results showed that mRNA transcription of MYH9 gene was reduced by 86.5% at 48 h after introduction of pGCsiMYH93. CONCLUSION: Plasmid pGCsiMYH93 could inhibit MYH9 expression in HUVEC cells successfully and effectively， which promised its further application in related function analysis of MYH9.

【关键词】 RNA 干扰; 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）; 非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）

　　非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（nonmuscle myosin heavy chain Ⅱ A， NMHCⅡA， MYH9）是一种由人第22号染色体上的MYH9 基因编码的蛋白， 它广泛分布于血管内皮细胞、 巨噬细胞、 T细胞、 中性粒细胞等多种细胞， 与胞质分裂［1］、 肿瘤转移［2， 3］、 血小板活化和血栓形成［4］、 血管收缩［5］等密切相关。同时， 血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用， 但有关MYH9在血管内皮活化中的作用， 尚未得到有效阐明。而利用RNA 干扰(RNAi) 技术可以较容易地制备特定基因缺失表型的个体， 表达shRNA 片段的RNAi 载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因， 方便快捷地研究该基因的功能［6-8］。因此， 本研究旨在构建针对人MYH9 基因的shRNA 表达载体， 筛选出抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYH9 表达的最佳转染质粒和最佳转染时间， 为进一步研究MYH9的功能提供技术手段， 为深入阐释MYH9 在血管内皮细胞活化相关的心脑血管疾病、 肿瘤转移等重大疾病中的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 M199 培养基、 胎牛血清、 TRIzol、 反转录试剂盒均购自Gibco 公司。pGCsilencerTM U6/neo/GFP/RNAi表达质粒载体、 阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、 阳性对照质粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP) 均购于上海吉凯生物技术公司。shRNA 插入模板寡核苷酸由TaKaRa 公司合成。限制性内切酶、 连接酶、 DNA Marker、 PCR 相关试剂均购自TaKaRa 公司。脂质体LipofectamineTM 2000、 DNA片段纯化试剂盒、 OPTIMEMI 培养基、 质粒小量提取试剂盒、 胶回收试剂盒均购自Invitrogen 公司。内皮细胞生长因子（ECGS）、 兔抗人MYH9 多抗购自Sigma 公司， 其余抗体均购自博士德公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。ECL 试剂盒购自Pierce 公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MYH9 shRNA 表达质粒的构建 针对GenBank 中MYH9 基因的已知序列(NM_002473)， 选择特异性shRNA 靶位点序列， 分别设计并合成3条shRNA 插入模板寡核苷酸（表1）， 退火后形成双链的shRNA 插入模板寡核苷酸。分别将这3条shRNA 寡核苷酸克隆到pGCsilencerTM U6/neo/GFP/RNAi 表达载体， 构建成干扰质粒 pGCsiMYH91、 pGCsiMYH92、 pGCsiMYH93， 分别转化大肠杆菌DH5α， 用质粒小量抽提试剂盒抽提、 纯化， 并用BamH I、 Hind Ⅲ 双酶切、 测序鉴定。

　　表1 MYH9 基因的shRNA序列信息（略）

　　Tab 1 Sequences of shRNA of MYH9 gene

　　1.2.2 人脐静脉内皮细胞的分离、 鉴定 参照文献［9］方法， 分离人脐静脉内皮细胞， 以添加200 mL/L胎牛血清， 40 U/mL肝素， 100 U/mL 青霉素， 100 mg/L链霉素及ECGS的M199 培养基， 37℃、 50 mL/L CO2细胞培养箱中进行培养。并按照试剂盒说明书的步骤， 采用Ⅷ 因子免疫荧光染色、 显色， 置荧光显微镜下观察鉴定。

　　1.2.3 干扰质粒及对照质粒的细胞转染 将第2代HUVEC 细胞按3×105个/孔接种于6孔细胞培养板中， 当细胞80%融合时， 参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书， 按 1∶2(g/L)比例， 分别转染质粒pGCsiMYH91、 pGCsiMYH92、 pGCsiMYH93 以及阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON 和干扰GAPDH 表达的阳性对照质粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)， 37℃孵育6～7 h后弃去培养基， 用PBS 洗涤细胞后， 加入含血清和抗生素的M199 培养液继续培养。

　　1.2.4 RTPCR 检测转染细胞中MYH9 mRNA表达 转染后24 h、 48 h、 72 h， 分别提取细胞RNA， 并用Oligo(dT) 反转录得cDNA。利用MYH9 和Actin 特异引物（表2）扩增cDNA 条带， PCR条件: 94℃变性30 s， 55℃退火45 s， 72℃延伸45 s， 共30个循环。扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 并利用GENEGENUS 凝胶成像分析系统进行光密度扫描， 比较转染不同质粒的细胞的MYH9 基因在mRNA 水平上的表达差异。

　　表2 RTPCR 引物序列（略）

　　Tab 2 Sequences of primers for RTPCR

　　1.2.5 Western blot检测转染细胞中MYH9 蛋白表达 转染后24 h、 48 h、 72 h收集细胞， 裂解， 用BCA 法蛋白定量后进行蛋白印迹实验［10］， 取80 g蛋白， 经100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后， 电转移至PVDF膜上， 转膜条件: MYH9（100V恒压转膜70～80 min）; Actin（100V恒压转膜50 min）。封闭液封闭后， 分别用MYH9和Actin 一抗4℃孵育过夜后， 相应二抗孵育2 h， 再用ECL 试剂盒检测。

　　1.2.6 统计学分析 实验结果采用SAS8.0软件进行统计学分析， 用方差分析各实验组之间的差别。

　　2 结果

　　2.1 MYH9基因shRNA 表达质粒的鉴定 重组后的 pGCsiMYH9表达质粒同时具有限制性核酸内切酶BamHⅠ、 Hind Ⅲ的酶切位点， 用BamHⅠ、 HindⅢ双酶切后， 电泳显现约1.8 kb和4.6 kb的2条带（图1）， 与实验设计的模板寡核苷酸长度相符。质粒用针对插入片段的特异性引物进行PCR 扩增， 并测定PCR 产物的DNA序列， 测序结果（未附）与实验设计的模板寡核苷酸序列相符， 表明MYH9 基因shRNA 表达质粒构建成功。而未重组对照质粒由于只含有BamHⅠ单酶切位点， 不含HindⅢ 酶切位点， 经BamHⅠ、 HindⅢ 双酶切后， 仅被BamHⅠ切成线性（图1）。

　　图1 MYH9 shRNA 表达质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig 1 AGE analysis of recombinant plasmid pGCsiMYH9 digested with BamHⅠ and HindⅢ

　　M: DL 2 000 DNA marker; 1: MYH9 shRNA expression plasmid; 2: MYH9 shRNA expression plasmid digested by BamHⅠ and HindⅢ; 3: Unrecombinant control plasmid digested by BamHⅠ and Hind Ⅲ.

　　2.2 干扰质粒及对照质粒的转染效率初步检测 由于所用的表达质粒带有绿色荧光蛋白（GFP）基因， 因此在检测转染细胞MYH9 基因 mRNA 及蛋白表达水平之前， 利用荧光显微镜观察各转染组的转染效率（以未转染细胞组为对照）， 有绿色荧光蛋白表达的细胞阳性率可达80%， 表明干扰及对照质粒可大量有效地进入HUVEC 细胞（图2）。

　　图2 重组质粒转染HUVEC细胞后48 h的荧光显微镜观察（略）

　　Fig 2 Observation of HUVEC cells transfected with recombination plasmid by fluorescence microscope (48 h after transfection， ×200)

　　2.3 转染细胞中MYH9 基因mRNA 表达水平的检测 以Actin 为内参， 半定量RTPCR 扩增出MYH9 基因特异条带（图3）。光密度扫描结果表明， 阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、 阳性对照质粒 GAPDH/homo(H1/neo/GFP)、 干扰质粒pGCsiMYH91 与未转染正常细胞MYH9 基因的mRNA 表达量之间无统计学意义， 说明pGCsiMYH91无效。而在转染后24 h、 48 h， pGCsiMYH92、 pGCsiMYH93对MYH9 mRNA 表达均有一定的抑制作用， 其中pGCsiMYH93在48 h 时作用最强。与阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON 转染细胞相比， 转染后48 h pGCsiMYH93 对MYH9 基因mRNA 表达的抑制率平均可达86.5%。转染后72 h， MYH9 基因mRNA 表达， 与正常细胞的MYH9 基因表达量之间无统计学意义。

　　2.4 MYH9基因蛋白表达水平的检测 图4为蛋白印迹结果。光密度扫描结果表明， 阴性对照质粒pGCsi.U6/neo/GFPNON、 阳性对照质粒GAPDH/homo(H1/neo/GFP)、 干扰质粒pGCsiMYH91 与未转染正常细胞的MYH9 表达量之间无统计学意义。而干扰质粒pGCsiMYH92 和pGCsiMYH93 在24 h 和48 h 时均对MYH9 表达有一定的干扰作用， 其中pGCsiMYH93 在48 h 时干扰作用最强， 对MYH9 表达的抑制率平均值可达71.2%， 与半定量RTPCR 所得的结论类似。转染后72 h， pGCsiMYH93 对MYH9 表达的抑制率降为20%， 仍高于转染后72 h 的mRNA 水平的抑制率， 表明蛋白水平干扰效应的消失稍滞后于mRNA 水平。

　　3 讨论
　　
　　近年来， 国内外大量研究表明MYH9（非肌肉肌球蛋白重链ⅡA）与细胞黏附［11， 12］、 细胞迁移［13］、 肿瘤转移［2， 3］、 动脉粥样硬化［14］、 血小板黏附、 血栓形成［4］等有着密切关系。例如: Huang 等发现MYH9 可将病理状态下血管内皮细胞中的核仁素迁移到细胞表面， 有助于核仁素在内皮迁移和血管新生中发挥作用［2］。Kohlstedt 等发现MYH9 能结合血管紧张素转移酶（ACE）， 并影响其磷酸化， 从而调节血管收缩与舒张［5］。Gachet 等发现MYH9缺陷可引起血小板减少， MYH9在血小板黏附及血栓形成中发挥着重要作用［4］。此外， Rho激酶介导的心血管疾病常常与MYH9磷酸化相关［15］， MYH9还介导细胞内的信号转导等等［16］， 但很多机制尚未完全阐明。因此， 剔除或降低其内源性表达， 对进一步深入研究MYH9的功能具有重要意义。

　　图3 pGCsiMYH91/2/3及对照质粒转染HUVEC细胞后RTPCR检测（略）

　　Fig 3 Determination of MYH9 mRNA expression by semiquantitative RTPCR in HUVEC cells transfected with RNAi plamids and their control plasmids

　　a， b: 24 h after transfection; c， d: 48 h after transfection; e， f: 72 h after transfection. b， d， f: Data are shown as means±SD for three separate experiments. *P&<0.01 significantly different from the negative control group. C: From cells untransfected; N: From cells transfected with negative control plasmid pGCsi.U6/neo/GFPNON; M1， M2， M3: From cells transfected with pGCsiMYH91， pGCsiMYH92， pGCsiMYH93， respectively; P: From cells transfected with positive control plasmid GAPDH/homo (H1/neo/GFP).

　　图4 pGCsiMYH91/2/3 转染HUVEC 细胞后的Western blot 分析（略）

　　Fig 4 Determination of MYH9 expression in HUVEC cells transfected with RNAi plasmids using Western blot

　　a: 24 h after transfection; b: 48 h after transfection; c: 72 h after transfection. d: Data are shown as means±SD for three separate experiments. *P&<0.05， **P&<0.01 significantly different from the M1 group. M1， M2， M3: from cells transfected with pGCsiMYH91， pGCsiMYH92， pGCsiMYH93， respectively.

　　RNAi 是指在生物体内， 外源性或内源性的双链RNA引起与其同源的mRNA 特异性降解， 导致转录后阶段的基因沉默。由于RNAi 技术具有高效、 特异、 简单易行、 资金消耗少等优点， 已经被广泛应用于蛋白功能的研究［6-8］。利用RNAi 技术抑制MYH9 基因表达虽有个别文献报道［2］， 但未见详细的抑制内皮细胞MYH9 表达的干扰质粒载体的具体序列信息以及最佳转染时间等报道。在本研究中， 我们构建了3种针对MYH9基因的siRNA表达体系， 观察其特异性抑制HUVEC细胞内源目的基因MYH9的作用， 结果表明转染后24 h， 2号、 3号干扰质粒均表现出对MYH9 表达一定的抑制作用。随后转染效率逐渐增强， 在转染后48 h达到峰值， 其中重组质粒pGCsiMYH93干扰效果最强， mRNA 转录水平及蛋白水平抑制率分别为86.5%和71.2%， 但随后干扰作用逐渐降低， 在转染后72 h， mRNA 转录水平的干扰作用消失， 但pGCsiMYH93 在蛋白水平的干扰作用仍然有20%， 表明蛋白水平干扰效应的表现稍滞后于mRNA 水平， 提示在后续利用重组质粒pGCsiMYH93 沉寂MYH9 基因， 研究MYH9 在相关疾病中的功能时， 应该选用在干扰作用最强的48 h 左右进行研究。
　　
　　综上所述， 本研究成功构建并筛选出了最佳干扰质粒pGCsiMYH93， 可明显抑制HUVEC细胞中MYH9 表达， 为进一步研究MYH9 在血管内皮活化中的作用以及在心血管、 肿瘤等相关疾病中的功能奠定了基础。

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