四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

　　　　作者：黄幼生，宋伟伟，邓晓佳，罗志飞，解娜

【摘要】 目的：探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixation and paraffin embedded tissues，FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法：采用Chelex100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA；应用聚合酶链反应扩增100～500bp长度DNA片段，然后进行电泳分析，1年后重复PCR电泳分析。结果：小于200bp长度DNA片段扩增，Chelex100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）（P&<0.01）及水煮法（21.3%）（P&<0.01）。随着扩增长度的增加，PCR扩增效率逐渐降低，Chelex100提取法PCR反应总阳性率为82.5%，单纯消化法为66.5%，水煮法为13.4%，酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论：Chelex100提取法方便简单，适用于微量石蜡组织DNA扩增分析；单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。

【关键词】 石蜡组织;DNA提取;Chelex100提取法

［ABSTRACT］ Objective: To explore the simple and effective method for DNA extraction from microamount formalin fixation and paraffin embedded tissues (FFPET). Methods: The DNA was extracted by four different methods: Chelex100 extraction， phenolchloroform purification， simple digestion method and water cooking method. The DNA fragment with 100500 bp length was amplified by PCR. It was analyzed by electrophoresis， and the procedure including PCR and analysis was repeated 1 year later. Results: For amplification of DNA less than 200 bp， the positive rates of Chelex100 group and simple digestion group were 88.8% and 78.8%， respectively， which were significantly effective than phenolchloroform purification group (15.0%) (P&<0.01) and water cooking group (21.3%) (P&<0.01). The amplication efficacy decreased as the length increase. The total positive rates of PCR were 82.5% in Chelex100 group， 66.5% in simple digestion group， 13.4% both in water cooking group and phenolchlorform group. And the positive rates in repeated assessment were 80.1%， 31.7%， 2.5% and 9.2%. Conclusions: Chelex100 extration method is easy and applicable in amplification analysis of DNA extracted from mircoamount paraffin embedded tissues; while simple digestion method and water cooking method are suitable to analysis of short length DNA fragment extracted from mircoamount paraffin embedded tissues.
　　
［KEY WORDS］ Paraffin embedded tissue; DNA extraction; Chelex100 extraction
　　医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织（formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET），为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔马林固定后的蜡块包埋组织DNA降解严重［1］，档存FFPET组织切取量有限，传统酚氯仿提取DNA步骤繁杂，提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用［2］。如何高效、高质量提取微量石蜡组织DNA对利用石蜡组织进行分子研究至关重要。本实验在前人及前期研究的基础上［3］，进一步探讨改善石蜡包埋组织DNA的提取方法及各种方法在不同条件下的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

　　
选用海南医学院附属医院病理科2006～2007年间存档的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、结肠癌石蜡包埋组织各25例。所用物品包括PCR仪(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京华美)、Chelex100(BioRad I～boratory)。

1.2 方法

黄幼生等.四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较
1.2.1 提取DNA方法 将每例石蜡包埋组织块切片6μm厚，分装于4个EP管中，每管5片(鼻咽癌组织10片)，切不同病例的蜡块时用二甲苯擦洗刀片2遍，以免交叉污染。先统一去蜡：在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒温摇床中，20min后12000r/min离心10min，去上清，加入新鲜二甲苯重复一次；再用无水乙醇洗涤2次以脱去二甲苯，离心后弃上清，在55℃恒温箱干燥沉淀。采用4种方法提取DNA：（1）单纯消化法：用100μL的组织裂解液（0.2%SDS，10mmoL/L TrispH8.0，0.5mmoL/LEDTApH 8.0）悬浮沉淀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化，55℃振摇8h或过夜至溶液澄清。98℃加热10min灭活蛋白酶K，冰上3min，12000r/min 离心取上清（DNA在上清液中），4℃储存备用。（2）Chelex100提取法：步骤同单纯消化法，提取上清后，在上清液中加入5%Chelex100颗粒，4℃过夜储存备用。（3） 酚氯仿抽提法：在EP管中加入200 mL蛋白酶K缓冲液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.0，5 mmol/LEDTA pH 8.0，0.2%Tween20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL)，置55℃水浴振摇过夜，取出后煮沸10min，离心，取上清；用等量酚—氯仿—异戊醇抽提2次；加2.5倍冰无水乙醇(-20℃)和1/10体积3mol/L乙酸钠沉淀DNA，-20℃静置3h；取出后4℃下14000 r/min 离心15min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温通风干燥沉淀后用50μL TE液(pH8.0)溶解DNA，4℃保存。（4）水煮法：在EP 管中加入100μL 去离子水。室温静置2h后98℃加热15min，12000r/min离心10min后取上清即为模板DNA。

1.2.2 PCR扩增 选择3对多态性位点引物，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列、退火温度及扩增片段长度见表1。PCR反应体系为25μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL；25mmoL/L MgCl21.5μL；10mmoL/L dNTP0.5μL；10vmoL/L引物各1μL；模板2μL；5U/μL Taq聚合酶0.5μL，余下由灭菌去离子水补足。经94℃变性5min后进入循环：94℃变性30min；退火45s；72℃延伸30s，完成35个循环后．于72℃下延伸5min。每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
表1 PCR扩增所用引物列表

引物名称序列长度（bp）退火温度（℃）

D1S3466ATGTCTTTGATCCTATGGAAGG18920956
TGGGTAACAGACCCTGTCTC

SS903GTCAGGGCGTCTTCCCAGTT28560

TGAGCCTCGGCATCTACATCTT
SS448AGGCGTGTCCTTTCGTTTCT46861
GCCACTCCCACTGCTCAA
1.2.3 DNA鉴定方法 （1）DNA质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定:取5μL DNA加1μL的DNA loading buffer混匀上样，在2%的琼脂糖凝胶中80V电泳30min，在紫外凝胶成像仪下观察所提取DNA基因组及PCR产物的质量并拍照存档。（2）DNA纯度量鉴定；各取5μLDNA样品，加水至500μL混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中，先用500μL水校正零点，于260nm和280nm处分别读出吸光度(OD)值，检测DNA的OD值。

2 结果

　　
海南医学院学报 Vol.16 No.9 Sep.2010

4种方法提取的DNA经凝胶电泳分析显示，Chelex100提取法、单纯消化法提取的DNA100%有条带出现，主要集中在400～1000bp；水煮法提取的DNA46.3%有条带出现，主要集中在100bp以下；传统酚氯仿提取的DNA15%有条带出现，主要集中在500～1500bp之间。4种方法提取的DNA经分光光度计测定显示Chelex100提取法、酚氯仿抽提法提取的DNA纯度无明显差异（P&>0.05），但优于另外2种方法(P&<0.05)。4种方法提取的DNA量及纯度见表2。

表2 4种方法提取的DNA平均纯度及产量（n=100）（±s）

提取方法纯度（260/280）DNA产量（μg/100mg）

Chelex100提取法1.73±0.3352.9±8.76
单纯消化法 1.18±0.31 55.4±10.41
水煮法 1.03±0.23 3.1±0.25
酚氯仿抽提法 1.78±0.29 1.2±0.57

　　
4种方法提取的DNA进行PCR扩增，小于200bp长度片段扩增，Chelex100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）及水煮法（21.3%）（P均&<0.01）。随着扩增长度的增加，PCR扩增效率逐渐降低，285bpDNA片段4种方法PCR扩增效率分别为86.8%（Chelex100提取法）、67.5%（单纯消化法）、13.8%（水煮法）、12.5%（酚氯仿抽提法）(图1)；485bp扩增效率分别为71.3%、52.5%、5%、12.5%。总的PCR反应阳性率分别为82.5%、66.5%、13.4%、13.4%。1年后4种方法提取的DNA重复PCR扩增，小于200bp片段PCR扩增阳性率无明显变化，但大于200bp片段扩增效率明显降低，总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。

注：1：Marker(100bp/band)；24：Chelex100法；57：单纯消化法；810：酚氯仿法；1113：水煮法；14：阳性对照；15：阴性对照

图1 不同方法提取的DNA PCR反应电泳图（引物SS903）

3 讨论

　　
新鲜组织的收集及长期保存困难，各医院存在大量各种疾病的石蜡包埋组织，石蜡包埋组织DNA的提取解决了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的这一难题［3］。

　　
FFPET的提取方法多种多样，如水煮法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、Chelex100提取法等［36］，均旨在更加高效、高质量地提取DNA。石蜡包埋组织DNA提取的数量及质量与组织的量、消化时间、纯化方法等有关［7］。本实验对脱蜡、消化做了一些优化。在剔除多余的蜡块后，把二甲苯脱蜡的时间、次数缩短，由传统的 3 h以上缩短到 1 h左右，同时减少操作步骤，这样就减少操作过程中DNA的丢失、断裂，达到减少原始蜡块组织成本的目的。消化过程中，消化时间过长可以充分消化组织，提高DNA的含量及纯度，然而时间的延长，又使得DNA断裂增加，且不利于连续操作，本实验选取消化时间主要以组织消化彻底，组织消化液变清亮为标准，微量石蜡组织在10～12h左右即可消化充分，无须消化3～4d。常规的纯化方法是酚氯仿反复抽提，随后高盐沉淀DNA、乙醇洗涤、干燥后溶解保存。这种方法步骤繁杂，DNA损失严重，微量石蜡组织通常看不到沉淀，而至提取失败。通过实验观察发现，石蜡组织中的蛋白质，均已变性，充分消化后对PCR反应造成的影响有限，对PCR反应影响较大的是其中的金属离子。Chelex100是一种金属离子螯合剂，能与镁、钙等核酸反应必需的二价金属阳离子螯合，从而保护DNA，并减少由降解的DNA片段形成的杂带，从而提高PCR反应阳性率及重复率［3］。

　　
酚氯仿抽提法是最为经典的提取方法，主要包括二甲苯脱蜡、蛋白酶K消化、苯酚/氯仿纯化、盐析4个步骤。由于操作过程过多，频繁移管，导致DNA损失、污染以及DNA断裂的可能。本实验结果显示该方法所提取的DNA质量较高，易于保存（1年后，PCR重复率为100%）。但需组织量多，提取效率低下，综合提取率仅为5%，其中鼻咽癌由于活检组织太小，提取率为零。因而该方法仅适用于需长期保存的大标本DNA提取。水煮法提取的DNA数量少，片段小，不易保存，重复率低，不适合长片段DNA分析，但操作简便，所需时间短，可应用于快速的短片段DNA鉴定。简单消化法与Chelex100法操作过程较简便，改良后只需12h左右即可完成。简单消化法提取的DNA含量与Chelex100法无明显差异，但纯度较低，PCR阳性率低于后者，两者相比差异有统计学意义（P&<0.05）。单纯消化法1年后的重复率下降较大，不易于保存；Chelex100法提取的DNA纯度较单纯消化法高，与其他方法相比，PCR阳性率及1年后重复率最高，与其他方法相比，差异有显著性(P&<0.01)。因而Chelex100法最适用于一般的FFPET的DNA提取，且易于保存。

　　
总之，甲醛固定石蜡包埋组织是一种信息含量大且经济的宝贵资源，但其中的核酸降解严重，如何高效高质提取其中的DNA来满足进一步实验研究要求值得探讨。Chelex100提取法方便简单，适用于微量石蜡组织DNA扩增分析；单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。

参考文献

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