ASPCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

　　　　 作者：薛丽，叶玉兴，易国辉，白玉杰

【摘要】 目的：建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P450 2C19基因多态性检测方法。方法：分离外周血淋巴细胞基因组DNA，分别用一对等位基因特异性(allelespecific， AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增，通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果：ASPCR可检测CYP2C19基因多态性，引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论：建立和优化的ASPCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。

【关键词】 细胞色素氧化酶2C19；遗传多态性；基因型；等位基因特异性PCR

［ABSTRACT］ Objective: To develop a rapid and sensitive method for genotype analysis of the CYP2C19 gene in Chinese population. Methods: The genomic DNA was extracted from lymphocytes. A common forward primer and one of the two allelespecific (AS) reverse primers were used in parallel PCR reactions. The PCR products were analyzed by electrophoresis and specific amplification indicated the presence of the allele. In order to enhance the PCR specificity， the extra mismatch based at the third or second nucleotide position from the 3′end of AS primers were introduced. Results: Two hundred and seventyeight DNA samples were analyzed by this new method. The CYP2C19 genotyping results derived from this ASAPCR were perfectly consistent with sequencing. Conclusion: The new method developed and optimized in this study is a suitable strategy for CYP2C19 genotyping. It also enables accurate and rapid detection of CYP2C19 polymorphisms.
　　
［KEY WORDS］ CYP2C19; Genetic polymorphism; Genotype; Allelespecific PCR

　　细胞色素氧化酶P450 2C19 (CYP2C19)是人体中重要的代谢酶。最初因催化S美芬妥英羟化代谢功能而被称为S美芬妥英羟化酶［1］， CYP2C19催化羟化、氧化及环化等反应，参与机体多种内源性及外源性化学物质的代谢。奥美拉唑、美芬妥英、安定、普萘洛尔等临床常用药物经CYP2C19代谢［2-4］，CYP2C19的功能与疾病风险及药物疗效都密切相关。

　　
CYP2C19活性存在个体间差异，以S美芬妥英为探针药物，依据其代谢速度分为强代谢表型（Extensive Metabolism，EM）和弱代谢表型（Poor Metabolism，PM）。研究发现个体间代谢表型差异的重要原因是其基因多态性，外显子5上的第681位密码子G&>A变异（c681G&>A，称为“m1突变”）和外显子4上的第636位密码子G&>A变异（c636G&>A，称为“m2突变”）是引起PM表型的最主要基因变异。亚洲人群95%以上PM表型由m1和m2变异决定［5，6］。

　　
分析CYP2C19基因多态性可推断代谢表型，从而预测解毒能力和患病风险，还可预测药物代谢能力、药物疗效及毒副作用，指导临床合理用药。本研究基于等位基因特异性PCR（allelespecific PCR，ASPCR）原理，建立了快速CYP2C19基因多态性检测方法，探索提高检测特异性的条件。并用所建立方法对健康人群CYP2C19基因多态性等位基因分布频率进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 基因组DNA提取

　　
278例健康体检者，男性155例，女性123例，平均年龄41岁。新鲜采集外周静脉血，EDTA抗凝保存。采用基因组DNA提取试剂盒（天根生物技术公司），参照使用说明书操作，提取基因组DNA，-80℃保存备用。

1.2 引物设计

　　
参照Genbank中CYP2C19基因序列（AY796203）和ASPCR原理［7］，采用OLIGO 6.0软件设计引物（图1）：针对每个变异位点设计一对等位基因特异性引物（AS引物），其3′末端分别与变异位点G或A碱基互补。M1ASRP1T和M1ASRP1C用于检测m1变异（c681G&>A）；M2ASRP1T和M2ASRP1C用于检测m2变异（c636G&>A）。为增加扩增特异性和检测分辨率，设计在3’端第3位(M1ASRP2T和M1ASRP2C)或第2位（M2ASRP2T和M2ASRP2C）引入错配碱基的ASPCR引物（表1）。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误，在AS引物下游设计了参照引物M1RefRP和M2RefRP。上游共用引物与一种AS引物用作突变检测，含对应等位基因的模板中可扩增PCR产物，而不含对应等位基因的模板则不扩增。在所有标本中参照引物与正向引物共同扩增较大的片段，作为PCR的系统内参照。检测c636G&>A的ASPCR产物为146bp，参照PCR产物为439bp；检测c681G&>A的ASPCR产物为143bp，参照PCR产物为309bp。

图1 引物设计示意图

表1 ASPCR引物序列

命名序列注释

M1ASFP5′ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT3′
M1ASRP1T5′GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCT3′
M1ASRP2T5′GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT3′3′第三位错配
M1ASRP1C5′TTTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTCCC3′
M1ASRP2C5′TTTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTGCC3′3′第三位错配
M1RefRP5′CAATGAATCACAAATACGCAAGC3′
M2ASFP5′TGTGCTCCCTGCAATGTGAT3′
M2ASRP1T5′AAAAAACTTGGCCTTACCTGGATT3′
M2ASRP2T5′AAAAAACTTGGCCTTACCTGGAAT3′3′第二位错配
M2ASRP1C5′AAAAACTTGGCCTTACCTGGATC3′
M2ASRP2C5′AAAAACTTGGCCTTACCTGGAAC3′3′第二位错配
M2RefRP5′ATGGAGTGATATAAGCACGCTTTG3′

1.3 ASPCR反应及条件优化

1.3.1 ASPCR扩增 30μL反应体系含2×PCR混合液15μL（北京天根生物技术公司）正向和反向引物各6pmol (分别为M1ASFP+M1ASRP1T；M1ASFP＋M1ASRP1C；M2ASFP＋M2ASRP1T；M2ASFP+M2ASRP1C），基因组DNA 50～100ng。反应条件为95℃预变性5min，随后采用TouchdownPCR反应：95℃变性30s、 65～56℃每循环下降0.5℃退火30s、72℃延伸45s，共20个循环，随后95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，共25个循环。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察。

　　
切下大小正确的特异性PCR产物条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生物技术公司）回收和纯化PCR产物，采用pGMT连接试剂盒（北京天根生物技术公司）克隆PCR产物至T载体，经测序验证正确的重组质粒（命名为pGM/681A、pGM/681G、pGM/636A、pGM/636G）用于后续反应条件优化和系统阳性对照。

1.3.2 温度梯度PCR优化退火温度 反应体积和反应体系同上，模板DNA改为5ng重组质粒。平行进行10管反应，设定温度梯度范围为55～68℃，各管的退火温度分别为：55.0、56.3、57.6、59.1、60.7、62.2、63.8、65.4、66.7、68.0℃。反应条件为95℃ 30s、55～68℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环。反应产物经用20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察结果，选择无非特异条带，特异性条带最亮的管所对应退化温度为后续反应的退火温度。

1.3.3 ASPCR检测 用重组质粒模拟各种基因型：pGM/681A模拟c681A/A纯合子、pGM/681G模拟c681G/G纯合子、0.5∶0.5比例混合pGM/681A和pGM/681G模拟c681G/A杂合子；pGM/636A模拟c636A/A纯合子、pGM/636G模拟c636G/G纯合子、0.5∶0.5比例混合pGM/636A和pGM/636G模拟c636G/A杂合子。用优化反应条件进行ASPCR扩增。

　　
对部分全血标本进行分析，每份标本分别用引物M1ASFP+M1ASRP1T；M1ASFP+M1ASRP1C；M2ASFP+M2ASRP1T；M2ASFP+M2ASRP1C进行4管反应。反应体积及组成同上，同时分别加入参照引物（M1refRP或M2refRP） 0.3pmol，基因组DNA 50～100 ng。PCR反应条件为95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s，共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察结果。

1.3.4 引物引入第二个错配碱基 为增加检测的特异性，用引入错配碱基的第二套引物M1ASRP2T、M1ASRP2C、M2ASRP2T、M2ASRP2C代替第一套引物，按“1.3.1～1.3.3项”重复操作，比较两组引物的分辨能力。

1.4 DNA测序

　　
随机挑选部分经ASPCR方法测定为纯合或杂合基因型标本，用共用正向引物和参照反向引物（M1ASFP+M1refRP或M2ASFP+M2refRP）进行PCR扩增，反应体积30μL，组成同“1.3.1项”，仅将AS引物替换为参照引物，PCR反应条件同“1.3.3项”。 PCR产物纯化后直接用ABI3130测序仪测序，以验证ASPCR检测准确性。

1.5 中国人群CYP2C19基因多态性分布

　　
采用第二套引物，用优化的反应条件对278例健康体检者全血标本进行检测，统计各基因型分布频率。

2 结果

2.1 优化ASPCR反应条件

　　
薛丽等.ASPCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性
温度梯度PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在55～68℃范围内多数可扩增出特异性产物，在58～60.7℃范围扩增产物量条带最亮，且无非特异产物。为获得较高SNP分辨力，选择较高的退火温度，以60℃作为后续反应退火温度。

2.2 ASPCR分析CYP2C19基因型

　　
用质粒模拟的各种基因型，ASPCR检测结果显示对各种基因型均可准确分辨（图2）。在此基础上，对全血标本进行ASPCR扩增，每个标本采用一对AS引物平行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示每个反应中均可见大小分别为439bp和309bp的参照PCR产物，特异性AS引物扩增产物大小分别为146bp和143bp。

　　
选择其中部分标本用参照引物扩增后测序，发现个别标本ASPCR检测为636G/A基因型，测序结果为636G/G基因型。采用第二套AS引物，对上述质粒和标本进行检测，结果发现引入了错配碱基的第二套引物较第一套引物的分辨率提高，消除了误判现象。

图2 ASPCR118对CYP2C19各基因型的检测

采用第二套引物对全部标本进行检测，依据每一对平行扩增产物判断变异类型和基因型（图3）。如标本1和6（S1和S6）M2ASRP2T和M2ASRP2C引物均有PCR产物，判断为c636G/A杂合基因型，标本2(S2) M2ASRP2C引物管无PCR产物，而M2ASRP2T管有产物，标本2为c636A/A纯合基因型，标本3～5（S3～S5）M2ASRP2T引物管无PCR产物，而M2ASRP2C管有产物，为c636G/G纯合基因型。

图3 ASPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2.3 DNA测序验证

　　
随机挑选部分样本，DNA直接测序验证ASPCR的基因分型结果（图4），所有检测结果均正确。

图4 CYP2C19基因测序结果

2.4 中国人群中CYP2C19基因多态性分布

　　
采用第二套AS引物和优化的反应条件，对278例健康体检者全血基因组DNA进行ASPCR分析。CYP2C19基因多态性分布频率分别为：纯合无变异88例（31.65%）、杂合m1变异（m1/w1）120例（43.17%）、纯合m1变异（m1/m1）30例（10.79%）、杂合m2变异（m2/w2）27例（9.70%）、纯合m2变异（m2/m2）2例（0.72%）、m1和m2杂合变异（m1/m2）11例（3.96%），与文献报道相一致。

3 讨论

　　
CYP2C19在人体代谢中发挥重要作用，奥美拉唑、兰索拉唑、西酞普兰、地西泮等抗酸药和抗抑郁药主要经CYP2C19代谢。CYP2C19参与前致癌物的体内活化和致癌物的解毒等，与乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠癌及白血病等多种肿瘤发生相关［8-11］。CYP2C19有EM和PM等代谢表型，PM表型在白人中少见仅为1%～2%，而在亚洲人群中频率较高，中国人约13%～18%，日本人则高达25%［12］。分析CYP2C19的活性对疾病风险预测及临床合理用药具有指导价值。CYP2C19活性最初采用S美芬妥英代谢速度判断，但美芬妥英药物存在较大的毒副作用。后有报道用奥美拉唑为探针药物，HPLC测定代谢产物的方法［13］，但操作复杂，且受多种因素影响，结果不稳定，不适合临床应用。

　　
近年来研究发现CYP2C19活性差异与其基因多态性相关，基因型与表型间有良好的一致性。基因检测较蛋白活性直接测定具有操作简单、结果稳定等优点。决定PM表型的主要基因多态性为m1和m2变异。m1变异(第5外显子c681G&>A)，形成异常拼接位点，致使转录时丢失40 bp（c643c682），蛋白翻译时丢失4个氨基酸（p215p227），且从第215位氨基酸密码子处发生移码突变，在其下游第20位密码子突变为终止子。最终生成丢失了血红素结合区的仅234个氨基酸的截短蛋白突变体，丧失催化活性。m2变异（第4外显子c636G&>A），色氨酸密码子突变为终止子，生成丢失了血红素和底物结合区的无活性蛋白。亚洲人群的PM表型73%～83%为c681G&>A，15%～25%为c636G&>A变异，通过对上述变异的检测，可推测CYP2C19代谢表型。

　　
本研究采用ASPCR原理建立快速基因分型方法，引物设计和PCR反应条件是决定ASPCR特异性和敏感性的最主要环节。ASPCR检测SNP主要基于AS引物与模板3′末端碱基错配不稳定性的程度，引入第二个错配碱基是增加错配不稳定性，提高检测特异性的有效方法。当3′末端碱基错配形成高度不稳定性时，则次位（倒数第2或3位）仅需引入弱或中等强度的错配；当3′末端碱基错配形成弱的不稳定性时，则次位（倒数第2或3位）需引入强的错配；据报道碱基错配不稳定性强度依次为：GA/CT/TT &> CC &>AA/GG &> CA/GT［14］。本研究AS引物的3′端形成CT错配，属于高强度错配，因此，分别在第2和第3位引入了中度强度的AA和GG错配。实验效果证实引入错配碱基提高了检测特异性。

　　
ASPCR反应的退火温度影响其特异性和敏感性。在建立方法时应优化退火温度，我们推荐采用温度梯度PCR确定退火温度，一次性平行比较多个不同退火温度的扩增效果，较为高效和准确。

　　
在反应体系中增设共用内标反向引物（M1RefRP和M2RefRP），浓度为ASPCR引物的1/20，用作PCR反应体系的参照； 除了可排除因PCR体系问题引起无扩增产物时误判为不含AS引物所对应等位基因之外；还增加反应体系中ASPCR的模板量，增加ASPCR产物量，起到类似“半巢氏”PCR的效果，提高检测的敏感性。

　　
迄今有多种基因分型方法，包括TaqMan［15］、基因芯片［16］、荧光偏振［17］、Pyrosequencing［18］、及Massarray［19］等高通量分析技术。但这些技术均需投入较大费用，购买昂贵的专用设备（如芯片阅读仪、焦磷酸测序仪、荧光偏振分析仪等）、合成探针或制备芯片等。如TaqMan和基因芯片的探针合成和制备费用较高，制备后无法改变，其选择的灵活性较小，尤其前期筛选合适探针的费用很高。本研究所建立的ASPCR方法只需要简单的PCR扩增和电泳设备，在小型普通分子生物学实验室即可方便开展，尤其适用于临床实验室。

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