异种表皮生长因子受体胞外段的表达及其抗肿瘤效果研究

　　　　 作者：李英辉 唐亮， 刘 倩， 陈德坤， 谈立松

【摘要】 目的: 构建异种EGFR蛋白疫苗并研究其抗肿瘤效果。方法: 用PCR方法获得鸡EGFR胞外片段， 与pGEX4T2载体连接， 并在E.coli BL21（DE3）中表达鸡的EGFR胞外片段与GST的融合蛋白， 融合蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化、复性后， 免疫小鼠， 免疫3次后， 接种小鼠Lewis细胞， 观测肿瘤生长情况， ELISA检测小鼠血清中抗EGFR蛋白的抗体效价。结果: 成功构建了EGFR胞外段基因的原核表达载体; SDSPAGE显示成功表达了目的融合蛋白; 融合蛋白免疫小鼠后， ELISA法检测到特异性抗EGFR抗体; 实验组与对照组肿瘤体积的比较结果显示， 融合蛋白疫苗能够在一定程度上抑制肿瘤的生长。结论: 异种EGFR蛋白能够克服免疫耐受问题， 诱导机体产生抗体， 有一定的抗肿瘤效果， 为后续的肿瘤疫苗研究打下了基础。

【关键词】 表皮生长因子受体; 胞外段; 原核表达; 抗肿瘤

　　表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor， EGFR)是一种广泛分布于哺乳动物各组织细胞膜上的多功能糖蛋白， 又称ErbB1， 是ErbB膜受体家族的成员之一， 其配体包括EGF、转化生长因子α（TGFα）、双向调节蛋白（amphiregulin）等。EGFR由胞外区、跨膜区以及胞内区构成， 其胞内区有酪氨酸激酶活性， 当胞外区与配体结合后， 会促使EGFR构象发生改变， 从而发生受体同源二聚化或者与家族其它受体如ErbB2等发生异源二聚化， 进而激活胞内区酪氨酸激酶活性， 启动EGFR通路信号传递［1］， 发挥其促进细胞增殖等一系列生物学活性。

　　EGFR在机体组织受到损伤等情况下， 能够发挥促进细胞增殖从而加速受损组织修复过程的作用， 然而当EGFR发生基因变异或者在细胞表面过度表达时往往会伴随着肿瘤等疾病的发生与发展。临床研究显示， EGFR在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈部肿瘤以及其他上皮源肿瘤中都存在高表达， 并与肿瘤患者病情进展、放化疗敏感性及预后直接相关［2］。自从1984年EGFR基因首次被克隆， 靶向EGFR策略在肿瘤治疗研究领域越来越受到研究者的重视［3］。我们采用原核表达系统表达了谷胱甘肽硫转移酶（GST）与鸡源EGFR胞外区片段的融合蛋白， 并对表达产物进行分离纯化及复性， 并以此融合蛋白进行动物实验， 评价其针对小鼠Lewis肺癌动物模型的主动免疫治疗效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pMD18T Vector购自宝生物工程有限公司， pGEX4T2 Vector、 小鼠Lewis、 人A431癌细胞株为本实验室保存、 E.coli BL21（DE3）， 为本实验室保存。质粒pVAXⅠcE（chicken EGFR）内含编码鸡EGFR胞外段cDNA部分片段由本室既往构建。4周龄 C57BL/6J 小鼠 (♀) 购自中国科学院上海实验动物中心。PCR体系kit、各种限制性内切酶、DNA片段纯化试剂盒、T4 DNA连接试剂盒、蛋白Marker， 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自上海华舜生物工程公司。山羊抗人EGFR抗体购自R＆D Systems， Inc.。兔抗羊HRP标记IgG购自Santa Cruz Biotechnology。DNA marker购自上海赛百盛基因技术有限公司。NiNTA Agarose 购自北京金螺旋生物科技中心。其余试剂及药品均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 表达载体的构建与鉴定 以本实验室构建的重组质粒pVAXⅠcE为模板， 设计上游、 下游引物， 上下游引物分别是: F: 5′GCGAATTCACGGTGGCGGGGGTGGGGGCCATGG

　　CTCCTGCGTTCGC3′， R: 5′GCCTCGAGTTCAGTGATGATGG

　　TGATGGTGGCCCCAGCAGCCCACGTC3′（上海赛百盛公司合成）， 上下游引物设计有EcoRⅠHind Ⅲ酶切位点， 另外上游引物设计有6个甘氨酸柔性接头， 下游含有编码His6标签的序列。按照常规方法进行PCR扩增目的基因， 之后将目的基因片段和原核表达载体pGEX4T2用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切并用试剂盒从凝胶中回收， 连接后， 转化DH5α感受态细胞， 对转化子抽提质粒进行双酶切鉴定， 并送赛百盛公司进行测序鉴定。重组后的表达载体命名为pGEX4T2cE。

　　1.2.2 GSTcE融合蛋白在E.coli BL21中的表达及包涵体的纯化 鉴定正确的重组质粒pGEX4T2cE转化感受态BL21（DE3）细菌， 挑取单菌落按常规方法以1 mmol/L IPTG诱导4 h， SDSPAGE分析外源蛋白的表达。确定表达后， 扩大诱导规模， 表达后采用超声破菌方法获得包涵体， 采用NiNTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白， 经核酸蛋白检测仪检测收集洗脱峰， 并做SDSPAGE分析。

　　1.2.3 包涵体的透析法复性 纯化后的蛋白溶液分别在4 mol/L， 2 mol/L尿素溶液中透析12~24 h。再将其放在含150 mL/L（V/V）甘油、 1 g/L（g/L）PEG2000、 0.5 mol/L精氨酸、 1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、 20 mmol/L TrisHCl(pH8.0)的复性溶液中透析复性24 h。最后用含9 g/L NaCl， 20 mmol/L TrisHCI(pH8.0)缓冲液透析48 h， 每6 h换液1次， 均在4℃下进行。

　　1.2.4 重组蛋白免疫实验动物 从上海实验动物中心购买4周龄C57BL/6 J雌性小鼠， 14只小鼠随机分成实验组和对照组， 实验组小鼠用目的蛋白对其进行3次免疫， 位置为腹股沟淋巴结处皮下， 间隔时间为10 d， 免疫剂量为100 μg/只， 前两次免疫用氟氏完全佐剂， 第3次用氟氏不完全佐剂。对照组用PBS缓冲液进行免疫， 免疫程序与蛋白疫苗组相同。

　　1.2.5 Lewis肺癌动物模型的建立及抗肿瘤效果评价 （1）Lewis肺癌动物模型的建立: 收集对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞， 1 500 r/min离心3 min， 细胞沉淀用培养液重悬并计数， 以2×106个细胞/只的量接种到经免疫的C57BL/6J小鼠腋部皮下。（2）ELISA法测定抗体的效价: 选取生长良好的A431细胞， 经消化后制成细胞悬液并计数， 接种于96孔板， 每孔100 μL， 约含细胞1×103个细胞， 置细胞培养箱待其贴壁后， 弃上清液并用戊二醛固定， PBST（PBS加入5 mL/L的Tween20）洗板3次。每孔加入200 μL封闭液（内含10 g/L BSA的PBST）， 封口膜封板， 37℃ 2 h， 倾去封闭液， GSTcE蛋白疫苗组与PBS对照组的待测血清用封闭液按1∶500; 1∶1 000; 1∶2 000; 1∶5 000; 1∶10 000稀释， 每孔100 μL， 空白组加入生理盐水100 μL， 各个处理设置3个复孔， 37℃孵育2 h， PBST洗涤后， 加入山羊抗小鼠IgGHRP 100 μL ， 37℃孵育2 h， 经PBST充分洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。15 min后硫酸终止， 酶标仪上测A450值。(3)肿瘤体积的测量: 待荷瘤小鼠肿瘤大小肉眼可见后， 用游标卡尺每周3~4次测量肿瘤长、 宽、 高径， 计算肿瘤体积V=0.52×长×宽×高， 绘制肿瘤生长曲线。

　　1.2.6 统计学分析 使用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 表达载体的构建及其鉴定 以本实验室既往构建的载体pVAXⅠcE为模版进行PCR扩增目的基因642 bp（图1A）， 经赛百盛公司测序与GenBank中登陆号为M20386的序列比对正确， 该片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后与表达载体pGEX4T2连接， 转化DH5α感受态细胞， 提取质粒进行酶切鉴定（图1B）， 筛选含正确大小外源片段的阳性克隆， 经测序鉴定重组质粒中插入序列为正确编码鸡EGFR胞外部分基因， 并含有编码His6的序列。

　　2.2 GSTcE融合蛋白在E.coli BL21中的表达及纯化 以pGEX4T2cE质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株， 平板筛选后得到含重组质粒的基因工程菌。挑取单克隆进行诱导表达， 条件为37℃， IPTG诱导4 h。超声破菌后目的蛋白大部分以包涵体形式存在， SDSPAGE显示， 在Mr 50 000附近有目的条带（图2泳道3）， 确定表达后， 放大规模诱导以获得大量目的蛋白， 破菌后包涵体经过初步处理采用镍离子亲和层析柱纯化， 纯化后得到相对单一的目的蛋白条带（图2泳道4）。

　　2.3 肿瘤体积的测量 为研究融合蛋白GSTcE疫苗能否抑制接种的肿瘤细胞成瘤， 小鼠预先免疫3次后接种肿瘤细胞， 大约1周左右各组均可清晰观察到小鼠腋下有瘤体生成， 随后每隔2 d测量一次肿瘤大小指标， 最终绘制荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图（图3）， 总体来看GSTcE组的肿瘤生长速度较NS对照组缓慢， 接瘤后19 d GSTcE组的平均肿瘤体积为3772.897 mm3而NS对照组平均肿瘤体积已经达到5470.14 mm3， 两者相比具有统计学意义（P&<0.05）。

　　2.4 ELISA检测抗体效价 间接ELISA法检测经3次免疫的小鼠血清抗EGFR抗体的效价结果如表1所示， GSTcE蛋白疫苗组血清稀释比例1∶500至1∶5 000时A450值与NS对照组比较有统计学意义（P&<0.05）， 从结果可判断GSTcE组抗体的效价为1∶5 000。由此可推断所表达的融合蛋白有较好的免疫原性， 能够刺激小鼠机体产生体液免疫效应。表1 小鼠血清抗EGFR抗体效价测定的ELISA结果

　　3 讨论

　　EGFR在很多人类癌症细胞中过量表达， 尤其是在非小细胞肺癌中， EGFR的过量表达与肿瘤病灶的高转移率、 肿瘤的侵袭力、 差的预后、 低存活率直接相关［4］。因此以EGFR信号转导途径为靶向的肿瘤治疗策略已经成为国际上的研究热点， 其中古巴分子免疫中心的一个小组， 采用哺乳动物细胞体外表达了小鼠和人EGFR的胞外部分， 免疫小鼠后， MTT法检测免疫小鼠的血清在体外能够抑止EGFR阳性肿瘤细胞的生长， 而且， 疫苗能够明显降低肿瘤细胞的肺部转移率［5］。

　　近年来， 肿瘤主动免疫治疗策略逐渐发展起来， 其中研究最多的是肿瘤相关抗原（TAA）， 例如CEA、 P53、 EGFR等。适合肿瘤主动免疫治疗的理想肿瘤相关抗原要有以下三个主要特点: 免疫原性强; 广泛表达于各种肿瘤细胞; 区分于正常细胞， 有肿瘤特异性。在动物模型中， 已经有学者成功利用异种同源分子进行免疫， 打破了宿主的免疫耐受， 激活了机体的免疫系统并产生一定的抗肿瘤效果［6］。这也是本实验表达异种同源蛋白进行抗肿瘤研究的根本原因。我们的前期研究曾将异源EGFR胞外部分片段展示在T7 噬菌体表面， 构建了基因工程噬菌体疫苗， 抗Lewis肺癌动物实验结果显示， 疫苗刺激小鼠产生了体液免疫与CTL细胞免疫效应［7， 8］。

　　为了研究EGFR靶向的主动免疫治疗肿瘤新策略， 我们构建了异种同源EGFR蛋白胞外部分区域的原核融合表达载体pGEX4T2cE， 并成功表达了融合蛋白GSTcE， 经过金属离子亲和层析纯化和复性后， 用此融合蛋白作为疫苗， 在接种肿瘤细胞前对小鼠进行3次免疫， 之后给小鼠接种Lewis肺癌细胞， 观测荷瘤小鼠的生长健康状况， 并记录肿瘤长、 宽、 高径， 计算肿瘤体积。与对照组小鼠相比， 蛋白疫苗组小鼠肿瘤生长缓慢， 同时， 在第3次免疫之后， 间接ELISA法检测蛋白疫苗组小鼠血清中存在抗EGFR的抗体， 抗体效价为1∶5 000， 与对照组有统计学意义， 证明所表达的异种蛋白对小鼠有免疫原性， 激活了小鼠针对EGFR的免疫应答， 与对照组相比在一定程度上抑制了肿瘤的生长。相信这种基于信号转导途径而设计的疫苗在经过更深入的前期研究后， 将会有很好的临床应用前景。

参考文献

［1］ Downward J， Yarden Y， Mayes E， et al. Close similarity of epidermal growth factor receptor and verbB oncogene protein sequences［J］. Nature， 1984， 307(5951): 521-527.

［2］ Jimeno A， Hidalgo M. Blockade of epidermal growth factor receptor(EGFR) activity［J］. Crit Rev Oncol Hemaol， 2005， 53(3): 179-193.

［3］ Baselga. Why the epidermal growth factor receptor? The rationale for cancer therapy［J］. J Oncologist， 2002， 7(Suppl 4): S2-8.

［6］ Pavelic K， Banjac Z， Pavelic J， et al. Evidence for a role of EGF receptor in the progression of human lung carcinoma［J］. Cancer Res， 1993， 13(4): 1133-1137.

［4］ Harari PM. Epidermal growth factor receptor inhibition strategies in oncology［J］. Endocr Relat Cancer， 2004， 11(4): 689-708.

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［6］ He QM， Wei YQ， Tian L， et al. Inhibition of tumor growth with a vaccine based on enogeneic homologous fibroblast growth factor receptor1 in mice［J］. J Biol Chem， 2003， 278(24): 21831-21836.

［7］ 曾宪卓， 刘 岽， 唐 亮， 等. EGFR基因重组T7噬菌体疫苗抗Lewis肺癌的实验研究［J］. 实验生物学报， 2005， 38(6): 481-488.

［8］ 蔡新华， 曾宪卓， 张尚权， 等. 表皮生长因子受体为靶向重组T7噬菌体抗肿瘤疫苗的构建及免疫活性［J］. 细胞生物学杂志， 2006， 28(2): 217-222.