糖皮质激素对哮喘豚鼠模型Eotaxin、 CCR3表达的调控

　　　　　　作者：吕丽丽， 朱述阳， 刘平莉

【摘要】 　　目的: 观察哮喘豚鼠外周血、 肺和骨髓组织嗜酸性粒细胞（EOS）百分比和肺组织Eotaxin和CCR3的表达及激素对其影响。方法: 健康雄性豚鼠40只， 以卵白蛋白（OVA）致敏和激发制作哮喘模型， 随机分为正常组（A组）、 哮喘组（B组）、 地塞米松干预组（C组）、 布地奈德干预组（D组）， 每组10只， 在末次激发6 h后处死豚鼠; 取豚鼠颈动脉血、 骨髓和肺组织， 分别制备血涂片、 骨髓涂片和肺组织切片; 外周血和骨髓涂片用Wright染色， 光学显微镜下计数细胞总数和EOS百分比; 肺组织切片HE染色， 光学显微镜下计数细胞总数和EOS百分比; 肺组织切片用Eotaxin和CCR3多克隆抗体免疫组化染色， 光学显微镜下分别计数阳性细胞百分比; 用Western blot法测定肺组织中Eotaxin蛋白表达变化。结果: 豚鼠外周血、 骨髓和肺组织中EOS百分比， A组为（1.33±0.52）%、 （1.17±0.41）%、 （1.67±0.52）%; B组为（4.83±0.98）%、 （3.17±0.75）%、 （4.00±0.89）%; C组为（2.68±1.03）%、 （1.67±0.82）%、 （2.83±0.75）%; D 组为（2.67±0.52）%、 （1.83±0.75）%、 （2.67±0.52）%; B组与A、 C、 D组比较差异有统计学意义（P&<0.05）， A组与C、 D组比较差异有统计学意义（P&<0.05）， C组与D组比较差异无统计学意义（P&>0.05）， 但C组较D组降低骨髓EOS百分比似乎更明显; 豚鼠肺组织Eotaxin和CCR3多克隆抗体免疫组化染色阳性细胞百分比， A组为（2.29±0.35）%、 （2.07±0.15）%; B组为（3.27±0.42）%、 （3.66±0.47）%; C组为（2.80±0.22）%、 （2.98±0.45）%; D组为（2.75±0.31）%、 （2.65±0.25）%; B组与A、 C、 D组比较差异有统计学意义（P&<0.05）， A组与C、 D组比较差异有统计学意义（P&<0.05）， C组与D组比较差异无统计学意义; 免疫印迹法检测发现豚鼠肺组织Eotaxin在A、 B、 C、 D组表达量分别为0.447±0.026、 0.836±0.012、 0.639±0.034、 0.668±0.023， B组表达较A、 C和D组明显升高（P&<0.01）， C组与D组比较差异无统计学意义， 但仍高于A组（P&<0.05）; 相关性分析结果提示哮喘豚鼠肺组织中EOS百分比和Eotaxin和CCR3在肺组织的表达皆呈正相关（r=0.852， P&<0.001）、 （r=0.671， P&<0.001）。结论: 哮喘豚鼠外周血、 骨髓和肺组织EOS均明显增加， 并与肺内Eotaxin和CCR3的表达相一致， 激素可通过抑制Eotaxin和CCR3的表达和活性， 有效发挥抗EOS炎症作用， 是激素控制哮喘发病的重要机制。

【关键词】 哮喘; 嗜酸粒细胞趋化因子; CCR3

　　哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、 肥大细胞、 T淋巴细胞、 中性粒细胞和上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。嗜酸性粒细胞（eosinophils， EOS）被认为是哮喘发病机制中强有力的关键效应细胞， 已证实哮喘患者气道黏膜下的EOS仅少数来自肺组织内的干细胞（CD34+）增殖， 其主要来源为骨髓干细胞在某些信号的驱动下分化成熟为EOS， 释放入外周血， 在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。在EOS趋化、 募集于肺组织内的过程中， 有很多细胞因子（如Eotaxin、 CCR3等）参与了对EOS的调控作用。因此深入研究Eotaxin、 CCR3在哮喘骨髓循环气道信号环路中的表达变化及EOS在哮喘发病中受何种因素影响， 为哮喘治疗研究提供新的思路和方向将有着很大的意义。本实验通过建立哮喘豚鼠模型， 观察哮喘豚鼠外周血、 肺和骨髓组织EOS百分比和肺组织Eotaxin、 CCR3的表达及激素的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 健康雄性豚鼠（40只， 体质量250～300 g）， 由徐州医学院实验动物中心提供。12 h光照/12 h黑暗， 室温为22～25℃， 湿度为40%～70%， 自由饮水。卵蛋白（OVA）购自美国Sigma公司。Eotaxin多克隆抗体、 CCR3多克隆抗体、 SABC法免疫组化检测系统和DAB显色试剂盒购自武汉Boster生物技术公司。地塞米松（DXM）购自天津药业焦作有限公司。布地奈德混悬液（BUD）购自无锡阿斯利康制药有限公司。奥林巴斯图像采集系统、 百瑞雾化器。

　　1.2 方法

　　1.2.1 哮喘模型的建立 参照Dandurand等［1］方法制作。哮喘组豚鼠腹腔注射OVA 100 mg和Al（OH）3 200 mg混悬液1 mL致敏。2周后将已致敏豚鼠置于自制雾化玻璃箱（20×30×40）cm中， 用10 g/L OVA雾化吸入诱发， 每次5只， 约20 min， 以出现口唇发绀、 呼吸急促、 烦躁等为止， 1次/d ， 连续5 d。正常对照组豚鼠腹腔注射生理盐水1 mL， 2周后予生理盐水雾化吸入1次/d ， 吸入时间为同批哮喘组诱喘最长时间。

　　1.2.2 实验分组 将健康豚鼠随机分为正常组（A组）、 哮喘组（B组）、 DXM干预（C组）、 BUD干预组（D组）， 每组10只。A组和B组每次诱喘前1 h腹腔注射生理盐水1 mL， C组每次诱喘前1 h腹腔注射DXM（1 mg/kg）（生理盐水稀释为0.2 g/L）， D组每次诱喘前1 h用喷射雾化器吸入BUD溶液0.2 mg。于第5天激发后6 h， 处死豚鼠取材作相应测定。

　　1.2.3 标本制备 于末次激发后6 h， 用100 g/L水合氯醛麻醉（2.5 mL/kg）动物后， 剖开胸腔， 取颈动脉血约1 mL涂片。取右侧股骨， 去掉两端骨骺， 用0.2 mL PBS液冲洗骨髓腔， 采集冲洗液涂片。外周血和骨髓涂片晾干后用Wright染色， 光学显微镜下计数400个白细胞， 计算其中EOS百分比。

　　1.2.4 肺组织EOS计数及Eotaxin、 CCR3表达的检测 无菌切取部分肺组织， 40 g/L多聚甲醛固定， 常规石蜡包埋、 切片， 分别进行HE染色， Eotaxin、 CCR3免疫组化染色（严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作）。肺组织HE染色后切片随机编号， 每张切片记数200个细胞， 计算其中EOS百分比。免疫组织化学的阳性细胞计数方法: 光镜下观察胞质着棕黄色为阳性细胞。每例选择1 张染色较好的切片， 显微镜下随机选取5个区域， 在高倍镜(×400) 下计数细胞数， 取每视野的均数， 结果以x±s表示。

　　1.2.5 Western blot法测定Eotaxin蛋白表达量 按Jiang等［2］方法， 剪取肺组织， 肺组织称重， 每1 mg组织加6 μL尿素裂解缓冲液［7 mol/L尿素、 2 mol/L硫脲、 65 mmol/L二硫苏糖醇、 40 g/L 3［3（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐（CHAPS）、 10 g/L蛋白酶抑制剂（cocktail）］， 置冰上1 h， 每15 min涡旋1次， 以10 000 r/min 4℃离心1 h， 取上清夜分装于-70℃保存。按Lowry法， 以牛血清白蛋白为标准品测定蛋白浓度。加入十二烷基硫酸钠（SDS）加样缓冲液， 置沸水中加热5 min， 按Pei等［3］方法， 每孔150 μg蛋白量加样， 经100 mL/L SDSPAGE分离后， 以湿转移法转至NC膜上， 加入30 g/L封闭液， 室温封闭3 h; 分别单独加入一抗（抗Eotaxin多克隆抗体1∶100）， 4℃过夜， 洗涤缓冲液（WB）洗膜6 min×3次; 加入相应的碱性磷酸酶（AP）标记二抗， 室温孵育2 h， WB洗膜6 min×3次; 加入显色剂（NBT/BCIP显色试剂盒）， 反应达到要求后流水洗涤终止反应。以鼠βactin作内参照。

　　1.2.6 统计学分析 实验数据采用Sigma plot作图软件及SPSS13.0统计软件分析， 数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）， 两两比较采用q检验， 研究结果相关性采用Pearson相关性分析。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组哮喘豚鼠气道的组织病理学 A组气道黏膜无明显水肿， 支气管管腔光滑， 无闭塞， 气道及血管周围未见炎症细胞浸润（图1A）。B组气道黏膜水肿明显， 表现为黏膜上皮细胞肿胀， 核被挤压至细胞边缘， 部分上皮细胞呈空泡样变性、 坏死、 脱失， 杯状细胞增多， 支气管管腔缩小， 甚至完全闭塞， 部分可见黏液栓。气道周围血管扩张充血， 气道黏膜层、 黏膜下层及血管周围组织有大量的炎症细胞浸润， 主要以EOS， 单核细胞及淋巴细胞为主， 黏膜基底层增厚（图1B）。C组和D组有轻度炎症变化， 较哮喘组明显减轻（图1C、 D）。

　　2.2 各组外周血、 骨髓和肺组织EOS计数 B组外周血、 骨髓和肺组织EOS百分比明显高于A组（表1）， 两组比较有统计学意义（P&<0.05）。C组外周血、 骨髓和肺组织EOS百分比较B组有显著性下降， 两组比较有统计学意义（P&<0.05）， 但仍高于A组（P&<0.05）。D组外周血、 骨髓和肺组织EOS百分比较B组有显著性下降， 两组比较有显著性差异（P&<0.05）， 但仍高于A组（P&<0.05）。C组与D组比较差异无统计学意义（P&>0.05）， 但C组较D组降低骨髓EOS似乎更明显。

　　图1 各组豚鼠肺组织病理形态学改变（HE， ×400）（略）

　　A: 正常组; B: 哮喘组; C: DXM组; D: BUD组.

　　表1 豚鼠外周血、 骨髓和肺组织EOS百分比（略）

　　aP&<0.05 vs正常对照组; cP&<0.05 vs哮喘组.

　　2.3 各组肺组织Eotaxin、 CCR3免疫组织化学染色结果分析 A组部分支气管、 细支气管上皮细胞Eotaxin、 CCR3呈弱阳性表达， 肺泡区阳性细胞数很少; B组Eotaxin、 CCR3主要表达于支气管上皮细胞， 支气管上皮细胞呈强阳性表达， 部分平滑肌细胞、 肺泡巨噬细胞、 肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞也有一定程度呈弱阳性表达， 嗜酸性粒细胞及部分淋巴细胞等炎性细胞也有表达， 阳性明显强于A组; C组和D组表达相对于哮喘组均有不同程度的减轻。B组肺组织Eotaxin、 CCR3阳性细胞百分比明显高于A组（表2）， 两组比较有统计学意义（P&<0.01）; C组肺组织Eotaxin、 CCR3阳性细胞百分比较B组有显著性下降， 两组比较有统计学意义（P&<0.01）， 但仍高于A组（P&<0.01）; D组肺组织Eotaxin、 CCR3阳性细胞百分比较B组有显著性下降， 两组比较有统计学意义（P&<0.01）， 但仍高于A组（P&<0.01）; C组与D组比较差异无统计学意义。

　　表2 豚鼠肺组织中Eotaxin和CCR3阳性细胞百分比（略）

　　aP&<0.05 vs正常对照组; cP&<0.05 vs哮喘组.

　　2.4 Eotaxin蛋白在肺组织中的表达 Western blot法检测豚鼠肺组织Eotaxin/βactin灰度比值， A、 B、 C、 D组表达量分别为0.447±0.026、 0.836±0.012、 0.639±0.034、 0.668±0.023。B组肺组织Eotaxin蛋白表达水平明显高于A组， 两组比较有统计学意义（P&<0.05）; C组肺组织Eotaxin蛋白表达水平较B组有显著性下降， 两组比较有统计学意义（P&<0.01）， 但仍高于A组（P&<0.01）; D组肺组织Eotaxin蛋白表达水平较B组有显著性下降， 两组比较有统计学意义（P&<0.01）， 但仍高于A组（P&<0.01）; C组与D组比较差异无统计学意义（图2）。

　　图2 豚鼠肺组织Eotaxin蛋白表达（Western blot法）（略）

　　1: 正常组; 2: 哮喘组; 3: DXM组; 4: BUD组.

　　2.5 相关分析 相关分析结果显示， 肺组织的EOS百分比分别与肺组织Eotaxin、 CCR3蛋白表达呈正相关（相互系数分别为0.852、 0.671， P&<0.001）。

　　3 讨论
　　
　　Eotaxin是一种特异性EOS趋化因子， 在过敏性炎症反应中Eotaxin能特异性地募集、 趋化和激活EOS。在正常的呼吸道， Eotaxin主要由气道上皮细胞产生［4］， 但是抗原致敏后， 嗜酸粒细胞和巨噬细胞却成为产生Eotaxin的主要来源， 使Eotaxin生成增加［5］。本实验发现豚鼠在OVA抗原致敏和激发后， 大、 中及小气道、 肺组织中部分结构细胞及炎症细胞合成Eotaxin蛋白增加， 而且哮喘组豚鼠肺组织中Eotaxin蛋白阳性细胞数和肺组织EOS百分数呈正相关， 提示EOS从骨髓外周血肺组织的迁移过程， 可能与Eotaxin有关。
　　
　　CCR3是CC趋化因子受体3， 最主要的激动剂为Eotaxin， Eotaxin、 CCR3介导了哮喘患者气道中大部分的EOS的浸润和活化。Lamkhioued等［6］研究报道， CCR3可表达于骨髓CD34+造血细胞表面， 在体内外Eotaxin与CCR3结合后均表现出明显的趋化活性， 促使骨髓中CD34+细胞产生增多。骨髓CD34+细胞是EOS的前体细胞， 可分化为EOS。Joubert等［7］报道， 哮喘患者和正常对照组相比， 其气道上皮细胞和平滑肌细胞表达CCR3明显增加， 在体外肺成纤维细胞表达CCR3明显增多［8］， 可以推测在Eotaxin表达增强的同时， CCR3表达也同步增强， CCR3不仅参与EOS的迁移与活化， 而且可能参与气道重塑。本研究发现CCR3在哮喘豚鼠肺组织表达与Eotaxin相一致， 都较正常组明显增强， 并且CCR3在肺组织中的表达与EOS在肺组织的浸润亦呈正相关。说明CCR3与Eotaxin一样都参与了EOS在从骨髓迁移到外周血再募集到肺组织这一信号环路， 在哮喘气道炎症中皆起着重要作用。这与我们既往研究亦相一致［9］。
　　
　　激素对骨髓和原位EOS造血的影响是多方面的， 包括阻遏骨髓及局部祖细胞的分化、 抑制炎性细胞的活化及炎症因子的产生等［10］。这是激素成为当前防治哮喘最有效的药物之一的原因， 但激素对EOS增殖、 分化和迁移是直接或是间接的影响， 目前尚不清楚。本实验中我们发现DXM和雾化吸入BUD皆能够显著减少哮喘豚鼠Eotaxin和CCR3的表达， 且与肺组织中EOS呈正相关， 抑制EOS的骨髓循环肺浸润。说明激素不论全身或局部应用均可通过抑制Eotaxin和CCR3的表达和活性， 发挥抗EOS性炎症的作用， 是激素控制哮喘的重要机制之一。

参考文献

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