维生素E抑制3T3L1前脂肪细胞的分化

　　　　 作者：郑奕迎，刘声远，马兰，龙儒桃

【摘要】 目的：研究维生素E对3T3L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法：利用MTT研究维生素E对3T3L1前脂肪细胞增殖的影响，利用油红O染色法测定维生素E对3T3L1前脂肪细胞分化的影响。结果：维生素E对3T3L1前脂肪细胞增殖无影响，10 ～100μmol/L维生素E能抑制3T3L1前脂肪细胞的分化。结论：维生素E对前脂肪细胞分化具有抑制作用。

【关键词】 维生素E；碘；3T3L1；增殖；分化；肥胖；MTT；油红O染色法

［ABSTRACT］ Objective: To study the effects of vitamin E on proliferation and differentiation of 3T3L1 preadipocyte. Methods: The effect of vitamin E on the proliferation of 3T3L1 was determined by MTT. Oil red O staining was used to determine the differentiation rate and level of 3T3L1 preadipocytes. Results: Vitamin E inhibited the differentiation of preadipocytes at 10 μmol/L and 100 μmol/L. Conclusions: Vitamin E could inhibit the differentiation of 3T3L1 preadipocyte.
　　
［KEY WORDS］ Vitamin E; Iodine; 3T3L1; Proliferation; Differentiation; Obesity; MTT; Oil red staining

　　维生素E除了具有抑制多元不饱和脂肪酸及磷脂质被氧化，保护细胞膜的抗氧化作用外，还具有许多非抗氧化的功能。我们以往的实验中发现维生素E对营养性肥胖小鼠具有降低体重的作用［1，2］，为了进一步研究其作用机制，本实验利用3T3L1前脂肪细胞研究维生素E对前脂肪细胞增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

　　
DMEM培养基和HEPES购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，1甲基3异丁基黄嘌呤（1methyl3isobuthylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、胰岛素（insulin）、 油红O（Oil red）、噻唑蓝（MTT）、维生素E均购于Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 3T3L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在5%CO2、37℃培养箱中生长，根据细胞状况每2天换一次培养液。3T3L1前脂肪细胞融合达70%时，胰蛋白酶消化、传代。

1.2.2 细胞增殖实验 将3T3L1前脂肪细胞以5×103的密度接种于96孔
板，分为4组，培养基中维生素E终浓度分别为0、1、10和100μmol/L（对照组及1、10、100μmol/L维生素E组），每组6孔。培养72h后用MTT比色法以波长490nm测定各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 细胞分化实验 实验分为对照组及1、10、100μmol/L维生素E组，每组6孔。配制诱导培养液为DMEM培养基＋0.5mmol/L的IBMX＋1.0μmol/L DEX+5mg/L的胰岛素，配制分化培养液为DMEM培养基＋0.5mmol/L的IBMX＋1.0μmol/L DEX。4组诱导和分化培养液中的维生素E终浓度分别为0、1、10、100μmol/L。将3T3L1前脂肪细胞5×103的密度接种于96孔板。细胞完全融合后2d（此时为诱导分化的第0天），换为诱导培养液，在第48小时（第2天）后换为分化培养液，第4天及以后的换液不加任何诱导分化剂，第8天细胞用10%的甲醛固定1h后，用油红O工作液（2mg/mL）染色2h，弃去油红O，用双蒸水充分洗干净，培养板放入37℃温箱使残余水分蒸发掉，用异丙醇溶解细胞内的油红O，在510nm波长测吸光度。

1.3 统计学处理　

　　
数据用±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素E对3T3L1前脂肪细胞增殖的影响

　　
1、10、100μmol/L维生素E组OD490与对照组比较，差异均无统计学意义（P&>0.05），见表1。

表1 维生素E对3T3L1前脂肪细胞增殖的影响（±s）

组别nOD490

对照组60.696±0.058

1μmol/L维生素E组60.668±0.067*
10μmol/L维生素E组60.689±0.031*
100μmol/L维生素E组60.630±0.095*

注：与对照组相比，*P&<0.05。

2.2 维生素E对3T3L1前脂肪细胞分化的影响

　　
1μmol/L维生素E对前脂肪细胞分化没有影响，而在10～100μmol/L 时可抑制前脂肪细胞的分化（图1、2，表2）。10μmol/L组、100μmol/L组细胞脂肪含量分别为对照组的57%、34%。

图1 维生素E对3T3L1前脂肪细胞分化的影响

　　注：A为对照组维生素E前脂肪细胞油红O染色；B为10 μmol/L组维生素E前脂肪细胞油红O染色；C为100 μmol/L组维生素E前脂肪细胞油红O染色

图2 维生素E对3T3L1前脂肪细胞分化的影响（×300）

表2 维生素E对3T3L1前脂肪细胞分化的影响（±s）

组别nOD510
对照组60.452±0.011

1μmol/L维生素E组60.413±0.010
10μmol/L维生素E组60.259±0.081*
100μmol/L维生素E组60.153±0.016*

　　注：与对照组相比，*P&<0.05。

3 讨论

　　
当前，肥胖症已经成为严重的社会问题，但是肥胖症的发病机制仍不明确。目前认为，在细胞水平上，肥胖症是由脂肪细胞增殖所引起的数目增多和/或分化所引起的体积增大所致。

　　
3T3L1前脂肪细胞是从小鼠Swiss 3T3纤维母细胞克隆出来的，在诱导剂（包括insulin、IBMX和DEX）作用下，能分化为成熟的脂肪细胞［3］，是目前常用的研究脂肪细胞增殖和分化的细胞模型。

　　
以往实验中发现维生素E可以降低营养性肥胖小鼠的体重，并且能够显著改善肥胖小鼠的血糖和血脂。本实验发现维生素E对前脂肪细胞增殖没有影响，10μmol/L和100μmol/L维生素E能抑制前脂肪细胞的分化。有研究发现，脂肪细胞可合成前列腺素，包括前列腺素E1 (prostaglandin E1， PGE1)、前列腺素E2 (prostaglandin E2 ， PGE2) 、前列腺素F2α (prostaglandin F2α， PGF2α) 以及前列环素(prostacyclin ， PGI2) ，可通过旁分泌的形式作用于脂肪细胞的多种前列腺素的受体［4］。前列环素的作用是促进前脂肪细胞内cAMP的升高，使其向脂肪细胞分化。PGF2α虽无促进前脂肪细胞内cAMP升高的作用， 但是可以促进磷脂肌醇降解和蛋白激酶C的激活，因而增强PGI2促进前脂肪细胞分化的作用［5］。PGE1和PGE2与受体结合后通过降低脂肪细胞内的cAMP而抵抗脂肪的分解。PGI2受体只在前脂肪细胞中存在， 随分化的进程，PGI2受体逐渐减少至消失，而PGE2受体逐渐出现［6］。PGE1可同时作用于PGE1、PGE2和PGI2受体［7，8］， 因此它同时兼有PGI2和PGE2 的作用， 既能升高前脂肪细胞内cAMP含量，促进其分化， 又能降低成熟脂肪细胞内cAMP的含量，增强脂肪细胞抵抗各种物质促进脂肪分解的作用。维生素E除了有抗氧化能力，还有许多非抗氧化作用。维生素E可通过直接与磷脂酶A2结合而使磷脂酶活性降低，抑制磷脂酶A2 的活性。由于磷脂酶的主要作用就是调控细胞膜磷脂释放花生四烯酸合成具有生物活性的二十碳烯酸。因此，维生素E通过抑制磷脂酶A2的活性而抑制前列腺素类的产生，进而抑制前脂肪细胞的分化。在本实验中，10、100μmol/L维生素E可以抑制3T3L1前脂肪细胞的分化，推测在前脂肪细胞中，维生素E可能是通过抑制磷脂酶A2 的活性，使前列腺素的产生减少而抑制前脂肪细胞的分化，但其确切机制需要进一步研究。

郑奕迎等.维生素E抑制3T3L1前脂肪细胞的分化

参考文献

1 郑奕迎，刘声远，刘海霞，等. 硒维生素E和碘对营养性肥胖小鼠的影响［J］.微量元素与健康研究，2006， 23（5）：35.

2 郑奕迎，刘声远，刘笑然，等.硒对3T3L1前脂肪细胞增殖和分化的影响［J］.海南医学院学报，2008，14（5）：489490，496.

3 Rubin CS，Hish A，Fung C，et al. Development of hormone receptors and hormonal responsiveness in vitro: insulin receptors and insulin sensitivity in the preadipocyte and adipocyte forms of 3T3L1［J］. J Boil Chem，1978，253（20）：75707578.

4 Borglum JD，Pedersen SB，Ailhaud G，et al. Differential expression of prostaglandin receptor mRNAs during adipose cell differentiation ［J］. Prostaglandins Other Lipid Mediat， 1999，57（56）: 305317.

5 Aubert J，Saint Marc P，Belmonte N ， et al. Prostacyclin IP receptor upregulates the early expression of C/EBPβ and C/EBPδ in preadipose cells［J］. Mol Cell Endocrinol，2000，160 (12):149156.

6 Vassaux G，Gaillard D， Darimont C，et al. Differential response of preadipocytes and adipocytes to prostacyclin and prostaglandin E2: physiological implications ［J］. Endocrinology，1992，131 （5）：23932398.

7 Vassaux G，Gaillard D，Ailhaud G， et al. Prostacyclin is a specific effector of adipose cell differentiation. Its dualrole as a cAMP and Ca2+ elevating agent ［J］. J Biol Chem，1992，267(16):1109211097.

8 Richelsen B. Relationship between binding and action of different prostaglandins in rat adipocytes with special reference to PGE2 and PGI2 ［J］. Biochem Pharmacol，1987，36(22):40174020