HPLC法测定注射用胸腺肽α1的含量

【摘要】 目的：改进注射用胸腺肽α1含量测定的方法。方法：色谱柱为Luna C18( 5μm ，4.6mm×250mm)；流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.7)乙腈(92∶8)，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min ；检测波长为210nm；柱温为室温；进样量20μL。结果：胸腺肽α1在0.05～0.8mg/mL 范围内具有良好的线性关系，r = 0.9999，平均回收率为99.4%。结论：改进后的方法操作简单，省时，重复性好，进一步完善了产品的质量标准。

【关键词】 高效液相色谱法；注射用胸腺肽α1；含量测定

［ABSTRACT］ Objective: To improve the content determination method for thymopetidum α1 injection. Methods：Content of 20μL thymopetidum injection was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) instrument fixed with a Luna C18 (5 μm ，4.6 mm×250mm). The mobile phase A was water with 0.05 mol/L KDP (pH5.7) and AN（92∶8）， mobile phase B was AN， and gradient elution was used. The flow rate was 1.0 mL/min， detective wavelength was 210 nm and column temperature was room temperature. Results：The linear range for content of thymopetidum α1 injection was 0.05～0.8 mg/mL， r=0.9999， the average recovery was 99.4%. Conclusion：The improved determination method is simple， timesaving with good repeatability， and can help to improve the quality standards of injective thymopetidum.
　　
［KEY WORDS］High performance liquid chromatography (HPLC)；Thymopetidum α1 injection；Content determination
　　注射用胸腺肽α1主要成分为胸腺肽α1，是化学合成的28肽，临床用于慢性乙型肝炎和作为免疫损害病者的疫苗免疫应答增强剂。在2010年版中国药典二部中收录的注射用胸腺肽α1标准［1］和国家食品药品监督管理局颁布的药品试行标准（YBh36822005）中规定的含量测定方法，梯度洗脱时间较长，操作繁琐且重复性较差。本实验对注射用胸腺肽α1含量测定方法进行了改进，现报道如下。

1 试药与仪器

1.1 试药

　　
胸腺肽α1对照品及注射用胸腺肽α1（海南某药品研发公司提供），对照品含量：99.78%，乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯。

1.2 仪器

　　
Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；DAD二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

　　
色谱柱：Luna C18 ( 5μm ，4.6mm×250mm)；以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.7)乙腈(92∶8)为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，在8min之内流动相B由3%增加到9%，在2min之内流动相B降为3%，并平衡5min，检测波长为210nm，进样量20μL，理论板数按胸腺肽α1峰计算应大于5000。

2.2 测定方法

　　
余邦良等.HPLC法测定注射用胸腺肽α1的含量
取本品适量，用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解，制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作为供试品溶液（临用前配制），精密量取20μL，注入液相色谱仪，参照高效液相色谱法［2］，记录色谱图；另精密称取胸腺肽α1对照品适量，用0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)溶解，制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作为对照品溶液（临用前配制），同法测定，按外标法以峰面积计算，其平均含量应符合规定。

2.3 辅料干扰试验

　　
按处方量精密称取甘露醇、氢氧化钠，并另取注射用胸腺肽α1，按“2.2项”制成辅料溶液和供试品溶液，分别取20μL注入液相色谱仪，按含量测定法记录色谱图（图1、2），从图谱上可以看出， 这些辅料在主峰吸收处均无吸收，故不影响注射用胸腺肽α1含量的测定。

图1 空白辅料色谱图

图2 注射用胸腺α1色谱图

2.4 回收率试验

　　
称取按处方量计算的辅料9份，分别加入标示量80%、100%、120%的胸腺肽α1，每种标示量各3份样，分别置相应的量瓶中，按“2.2项”制成供试品溶液，按含量测定方法，记录色谱图，计算其回收率。平均回收率为99.4%，RSD为0.25%。

2.5 精密度试验

　　
取同一批号的注射用胸腺肽α1 6瓶，按“2.2项”制成供试品溶液，按含量测定方法，每个供试品溶液平行测定6次，记录色谱图，主峰面积的RSD为0.34%。

2.6 配液稳定性试验

　　
取注射用胸腺肽α1适量，按“2.2项”制成供试品溶液，将其放置在20～25℃的室温下，分别于配样后第0、2、4、8、12h取样按含量测定方法分析，主峰面积的RSD为0.54%，结果表明供试品溶液在12h内较稳定。

2.7 线性试验

　　
取注射用胸腺肽α1适量，按“2.2项”制成1mL中约含胸腺肽α1 1mg的溶液，并分别稀释成含胸腺肽α1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液，按含量测定方法测定，记录色谱图，以进样浓度X（mg/L ）为横坐标，胸腺肽α1峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。计算其线性方程为：Y=18980X+13480433，r=0.9999。线性范围0.05～0.8mg/L。

2.8 样品含量测定

　　
取注射用胸腺肽α1 8瓶（1.6mg/瓶），各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)1.6mL溶解，合并，精密吸取5mL置50mL量瓶中，稀释至刻度，制成1mL中约含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作为供试品溶液（临用前配制），精密量取20μL，注入液相色谱仪，按高效液相色谱法［2］，记录色谱图；另取经五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽α1对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算其平均含量。3批样品含量分别为100.9%、100.1%、100.2%。

3 讨论

　　
原法 “YBh36822005” 的含量测定的梯度洗脱，在20min内流动相B由0增加到9%，然后在1min内流动相B降为0，并用流动相A平衡10min。经试验发现该法耗时长，且重现性差。本文对其梯度洗脱法进行修改：在8min之内流动相B由3%增加到9%，在2min之内流动相B降为3%，并平衡5min。

　　
通过方法学研究，发现各项试验均符合规定，且与原法的含量检测结果一致，同时克服原法检测时间长、重现性差的缺点。使用该法测定含量准确、快速、简便，专属性提高，有利于更好地控制产品质量，进一步完善产品的质量标准。

参考文献