内皮细胞相关黏附分子的研究进展

【摘要】 　　白细胞黏附于血管内皮细胞并渗出内皮细胞层是免疫反应的关键和重要步骤。此过程不仅需要激活白细胞及其膜表面黏附分子， 而且需要内皮细胞上相关的黏附分子的调控。目前研究已由研究黏附生理过程转向研究此过程的分子机制。本文主要介绍与此过程相关的内皮细胞黏附分子的基因表达、 信号转导通路调控以及对细胞功能的影响等的最新研究进展。

【关键词】 内皮细胞; 细胞黏附分子; 白细胞渗出; 信号转导

　　白细胞黏附血管内皮细胞并渗出内皮细胞层 (transendothelial migration， TEM) 是免疫反应的关键步骤。而细胞黏附分子不仅可以调节细胞和细胞间相互作用、 细胞和细胞基质之间的黏附， 在细胞对周围环境的反应过程中也起重要的调节作用。研究发现， 白细胞黏附并渗出内皮细胞过程中， 内皮细胞的激活及细胞膜表面相关黏附分子的表达和调控必不可少， 如ICAM1(intercellular adhesion molecule1)和VCAM1(vascular cell adhesion molecule1)等。它们不但能够通过改变内皮细胞层的透过性来实现短时间的渗出效应， 并且能够激活下游相关信号通路来调节蛋白的转录和翻译， 实现长时间的渗出效应， 这些过程不但需要调节胞质内钙离子浓度和肌动蛋白纤维的构型， 而且需要一些小的GTPase、 ROS (reactive oxygen species) 和一些相关蛋白激酶的参与［1， 2］。

　　1 内皮细胞黏附分子及其在TEM中的作用
　　
　　白细胞黏附并渗出血管内皮细胞可分为四步: 初次黏附 (tethering and rolling， primary adhesion) ， 白细胞的激活 (activation)， 紧密黏附 (tight adhesion， secondary adhesion)和渗出 (diapedesis)。其中， 在初次黏附过程中， 主要是通过内皮细胞表面的Eselectin、 Pselectin和CD34与淋巴细胞上ESL1、 PSGL1和Lselectin糖基相连， 使白细胞降低其流动速度并在内皮细胞层表面旋转。于此同时， 选择素的连接和聚集会激活白细胞内相应信号通路的变化而使其释放一些炎症介质分子， 如趋化因子(chemokine)、 细胞因子(cytokine)等， 激活整合素使得白细胞与内皮细胞更容易发生紧密黏附。紧密黏附主要是白细胞膜表面上整合素如VLA4， LFA1等与内皮细胞表面上的免疫球蛋白超家族如VCAM1和ICAM1相结合［3］。最后白细胞通过细胞旁途径 (paracellular pathway)或者跨细胞途径 (transcellular pathway)渗出内皮细胞层到达炎症部位， 细胞旁途径中有6种细胞黏附分子如VEcadherin、 PECAM1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule1)、 CD99、 JAMA、 JAMB和JAMC (junctional adhesion moleculeA， B， C)等在其中起重要的调控作用， 而对于跨细胞途径其机制目前仍不太清楚， 但有研究表明其需要ICAM1介导［4］。并且有研究证实， 在整个过程中ICAM1的聚集可影响其他黏附分子的表达量， 从而推测ICAM1在整个TEM过程中起核心调节作用［5］。

　　2 内皮细胞黏附分子调控的分子机制
　　
　　白细胞如要成功渗出内皮细胞层需要相应黏附分子的表达， 而黏附分子会启动其下游的一些细胞信号通路， 这种具体的分子调控机制是当前研究热点和关键。许多黏附分子都具有跨膜的结构， 由胞外区、 跨膜区和膜内区构成。其胞外区通常有与整合素等相应受体相结合的结构位点， 而膜内区则含有磷酸化位点或者与细胞骨架蛋白相连， 一旦胞外区被激活则会引起膜内区结构的变化从而影响下游信号通路。如ICAM1和VCAM1富含与Factin相连的结构， 这种结构能延伸至细胞膜外与淋巴细胞相连［6］。

　　2.1 Eselectin(CD62 E) 选择素家族除了可以介导初次黏附， 并使得白细胞在内皮细胞表面旋转; 它们与其受体的结合也能够启动其下游的信号通路。当中性粒细胞和记忆性T淋巴细胞渗出内皮细胞时， Eselectin的膜内区尾部结构与Ras 结合， 酪氨酸磷酸化其下游Raf 和MEK蛋白， 激活p42MAPK/ERK信号通路来调控cfos的活性， 并且发现Eselectin还可以影响肌动蛋白骨架的构型， 但具体机制仍不清楚。进一步研究发现酪氨酸磷酸化是通过补充和激活Eselectin的胞质区尾部SHP2磷酸酶， 进而激活Shc和Grb2调节蛋白， 从而调控RasMAPK信号通路［2］。并且Eselectin可停留在含有小窝蛋白的脂筏中(caveolincontaining lipid rafts)， 并与磷脂酶Cγ相结合。当脂筏破裂时， 会抑制磷脂酶Cγ的活化， 但对MAPK没有影响。由此可见， 不同的膜的结构域可调控不同的信号转导通路［7］。

　　2.2 ICAM1(CD54) ICAM1是白细胞渗出内皮细胞层过程中最核心的分子， 尤其是在淋巴细胞和中性粒细胞的渗出过程中。内皮细胞正常情况下ICAM1表达量较低， 在炎症反应中其表达量显著升高［8］。ICAM1主要通过其膜内区尾部C末端29个氨基酸的结构来调节下游信号通路。这种结构与EMR (ezrin， moesin， radixin)蛋白和α辅肌动蛋白相连。当ICAM1被激活后， 一方面其可以激活p60src激酶， 导致人皮层肌动蛋白(cortactin)磷酸化， 从而引起胞质内钙离子的下降从而激活Rho蛋白激酶， 最后导致细胞肌动蛋白收缩， 内皮细胞收缩性变大。另一方面ICAM1能够通过激活黄嘌呤氧化酶来激活p60src， 并且通过SHP2依赖性途径使得ezrin和p38 MAPK上酪氨酸磷酸化， 从而影响肌动蛋白的应力构型［9］。由此可见， ICAM1的激活可增加内皮细胞层的透过性， 从而导致白细胞更容易渗出。另一方面， ICAM1的聚集可使得ERK和JNK磷酸化， 激活其信号通路， 并通过fos和jun调控相关基因的表达， 进而影响VCAM1、 RhoA等的表达。

　　2.3 VCAM1(CD106) VCAM1是整合素VLA4(α4β1)在内皮细胞上的受体， 正常条件下内皮细胞中不表达， 炎症刺激后才开始表达。VCAM1的膜内区尾部有一个由19个氨基酸构成的位点可作为与Ⅰ型PDZ结合的基序， 已经证实这19个氨基酸位点可以与ezrin和moesin结合来调控下游信号通路， 然而对于Ⅰ型PDZ结合基序的作用仍然不清楚［6］。VCAM1的聚集可以激活Rac1蛋白， 从而使活性氧家族ROS(reactive oxygen species)表达量增加， 从而激活p38MAPK信号通路并且改变肌动蛋白纤维的应力结构。VCAM1也可以通过激活Rho蛋白来启动下游信号通路［5］。由于ROS可以修复内皮细胞间的黏附， 并且可以通过间接刺激酪氨酸激酶的活性来调控内皮细胞的整合性。ROS还能够通过调节MMP的活性， 影响VE钙调素的活性， 从而控制内皮细胞间连接的紧密程度， 调控白细胞渗出。而Rac可通过内皮细胞膜表面上的NOX2(the NADPH oxidase 2)来调节细胞外的ROS的浓度。因此， VCAM1与VLA4的结合可通过RacROS通路来控制白细胞向内皮细胞层的渗出［10］。
　　
　　ICAM1和VCAM1对于白细胞渗出内皮细胞层都是十分重要的， 并且由于两者在内皮细胞膜上的位置很接近， 因此当白细胞通过β1和β2整合素介导渗出时， 两者所引起的信号通路可能是相互联系的。但仍需进一步的研究来弄清楚其中的具体关系［1］。

　　2.4 PECAM1(CD31) PECAM1属于免疫球蛋白超家族， 主要通过其同源性结合介导白细胞和内皮细胞的连接以及内皮细胞之间的相互连接。在体外实验中， 已经证实阻断PECAM1与其受体结合可抑制中性粒细胞和淋巴细胞的渗出。与其他免疫球蛋白超家族分子不同， PECAM1含有一个扩展的胞质区尾巴， 上面含有两个免疫受体酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosinebased inhibition motifs， ITIM)， 它们在类src蛋白激酶作用下， 易发生酪氨酸磷酸化， 进而对细胞刺激和PECAM1的同源性结合起主要的反应［11］。后续研究进一步表明， 这种免疫受体酪氨酸抑制性基序主要通过与SHP1和SHP2上的酪氨酸磷酸酶、 SHIP功能区(Sh3 domaincontaining inositol 5phosphatase)和Grb2、 βcatenin、 γcatenin蛋白结合进而被磷酸化， 从而启动下游信号通路。与Eselectin一样， PECAM1可通过其SHP2结构域激活MAPK通路， 并且PECAM1还可通过激活Rap1刺激整合素的黏附。尽管PECAM1所介导的信号通路的研究已经广泛的开展了， 但对于其在白细胞渗出过程中的信号转导机制仍然不清楚［12］。

　　2.5 JAMs JAM家族主要集中在内皮细胞紧密连接处， 且白细胞渗出需要JAMs参加。研究推测JAM蛋白可通过C末端PDZ集合基序与ZO1、 AF6、 Par 3和MUPP1蛋白结合来调控相关信号通路进而调节内皮细胞极性和内皮细胞之间的连接， 但JAMs在白细胞渗出过程中具体的信号调控机制仍不清楚［13］。近年来， 随着白细胞渗出内皮细胞层相关研究的逐步深入， 已经证实这种渗出过程的分子调控机制是十分复杂的， 它们形成了一种网络化的结构（图1）。白细胞渗出内皮细胞层时， 内皮细胞膜表面不但会形成一种“袜子结构”， 并且通过其上的ICAM1与VCAM1与白细胞上相应整合素结合， 启动下游信号转导通路， 引起细胞肌动蛋白收缩和内皮细胞间连接紧密程度的下降， 从而使得白细胞更容易的渗出， 但其中许多具体的作用机制尚不清楚［3］。

　　图1 白细胞渗出内皮细胞层信号转导图（略）

　　3 影响因素
　　
　　白细胞渗出内皮细胞不但需要相应的黏附分子相识别， 而且受一些因素的影响。如白细胞的种类， 淋巴细胞、 中性粒细胞和单核细胞在渗出过程中可表达不同的黏附分子。不同的炎症刺激分子， 如TNFα、 IL2等可引起不同黏附分子的表达及调控［14］。血液流动剪切力也可引起黏附分子调控变化， 如已经证实VCAM1、 Eselectin都具有剪切应力的依赖性， 剪切力的增大可激活ERK2通路， 从而引起肌动蛋白构象的变化; 同时， VE钙调素和PECAM1的活性也受剪切力影响。另外， 扰动流场附近的内皮细胞内， src和PI3K/Akt通路可被激活， 从而激活NFκB转录调控因子， 引起基因表达的变化［15］。

　　4 结语
　　
　　目前， 有关白细胞渗出内皮细胞的研究主要集中在体外环境下， 但随着研究方法和研究条件的不断更新与进步， 已经开展部分在体内条件下的研究， 并发现体外与体内条件下， 其渗出的机制不尽相同， 如在体内条件发现了跨细胞途径。但在体内条件下具体的渗出机制还有待进一步研究。而对于一些黏附分子如PECAM1、 JAMs、 VE钙调素等其在渗出过程中具体的调节机制尚不清楚， 并且由于一些黏附分子介导的信号通路是相互联系且形成网络化结构， 因此需要做更为细致的研究， 系统生物学可能在此过程中起关键作用。

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