DCSIGN特异性适配子的筛选及鉴定

　　　　 作者：陈芳， 曾洁， 孙平， 潘勤， 章晓联

【摘要】 　　目的: 筛选高特异性、 高亲合力结合DCSIGN的单链DNA适配子， 为开发抗HIV、 HCV和结核杆菌感染的新型预防和治疗试剂奠定基础。 方法: 采用基于细胞表面展示的SELEX技术（TECSSELEX）， 筛选出具有高亲合力结合DCSIGN的单链DNA（ssDNA）适配子; 运用流式细胞术（FCM）检测该适配子的亲合力; 对最高亲合力适配子库进行克隆和测序; ELISA和FCM方法检测单适配子ZD8与DCSIGN蛋白结合的剂量相关性; MTT法测定IC50观察适配子对细胞的毒性。 结果: 第14轮筛选的适配子库亲和力最高; DCSIGN抗体能抑制适配子结合表达DCSIGN蛋白的细胞; 第14轮库中筛选的单适配子ZD8 与DCSIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性; 所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性。结论: 成功筛选出DCSIGN蛋白的ssDNA适配子， 为防治HIV、 HCV和结核杆菌感染等DCSIGN相关性疾病， 提供新型预防和治疗的候选试剂和小分子药物。
　　AIM: To develop the high affinity DNA aptamers which can selectively recognize DCSIGN protein as putative preventive reagents and drugs against infectious diseases. METHODS: A technique of cell surfaceSELEX (TECSSELEX) was employed to screen the DNA aptamers recognizing DCSIGN displayed on the surface of NIH3T3 cells. Some aptamers from the aptamer pools with the highest affinity were cloned. The binding affinities between the aptamers and target cells were measured by flow cytometry and ELISA. The values of IC50 were determined to detect the toxicity of aptamers for cells by MTT method. RESULTS: The 14th aptamer pool had the highest affinity and the binding rates between single aptamer (ZD8) and DCSIGN protein were in a dose dependent manner. DCSIGN antibody can competitively inhibit the binding reactions between the aptamers and their target cells. The selected aptamers have very low or no toxicity for hepatic cells. CONCLUSION: The selected DNA aptamers bound to DCSIGN protein with high affinity and specificity have been successfully selected， and they can be used both as preventive reagents and drugs against infectious diseases， such as AIDS， hepatitis C and tuberculosis.

【关键词】 DCSIGN; 适配子; TECSSELEX

　　DCSIGN 可通过其对靶细胞的捕捉， 将病原体直接带到靶细胞附近， 增加感染机会， 使DC成为病原体的传播者。近来的研究证明， DCSIGN为广谱的病原受体， 除了可与HIV1、 HCV结合外， 还可与其他多种病原体结合［1］。因而， 通过阻断DCSIGN从而阻断HIV、 HCV、 结核杆菌等病原体感染途径有望成为预防和治疗病毒性疾病的有效策略。
　　
　　SELEX技术是在体外运用大容量的随机寡核苷酸文库与PCR扩增技术相结合， 以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸， 经过多轮筛选， 获得高亲合力、 特异性强的寡核苷酸适配子（aptamers）［2， 3］。TECSSELEX技术是将细胞作为筛选介质的SELEX筛选方法， 筛选中表面表达靶分子的细胞作为阳性正筛细胞， 没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞［4］。我们将表达DCSIGN蛋白的NIH3T3DCSIGN细胞作为阳性正筛细胞， 运用SELEX技术对DCSIGN靶蛋白进行正向筛选， 并用不表达DCSIGN蛋白的NIH3T3细胞进行反向筛选， 最终获得能结合DCSIGN靶蛋白， 同时可拮抗HIV、 HCV病毒颗粒结合DCSIGN蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子， 以期开发预防和治疗感染性疾病的新型试剂。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 细胞、 细菌和质粒 NIH3T3细胞（不表达DCSIGN蛋白的阴性反筛细胞）， NIH3T3DCSIGN细胞(表达DCSIGN蛋白的阳性正筛细胞， 本实验室转染并鉴定)。大肠杆菌DH5α， pUC19质粒为本实验室保存; DMEM培养基以及RPMI培养基购自Gibco公司; DNA Taq polymerase和dNTP购自TaKaRa公司; DNA纯化试剂盒购于OMEGE公司、 T4 DNA连接酶和DNA marker为MBI公司产品; DCSIGN兔抗人多克隆IgG 购自Santa Cruz Biotechnology公司; HRP标记的羊抗兔IgG购自飞羿科技公司; FITC标记的引物和PE标记的羊抗兔IgG抗体购自Ebioscience 公司; HRPstreptavidin 购自ptglab公司; Gene Amp PCR System 2400 PCR仪(Foster city CA94404， USA)， DMLA (CW4000， Leica Germany)， U3400（Hitachi）分光光度计， 流式细胞仪（Beckman EPCS ALTRA Ⅱ， USA）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 NIH3T3细胞（不表达DCSIGN蛋白的阴性反筛细胞）和NIH3T3DCSIGN细胞(表达DCSIGN蛋白的阳性正筛细胞， 本实验室转染并鉴定)， 用DMEM培养液（含100 mL/L胎牛血清， 1×105 U/L青霉素和0.1 g/L链霉素）于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养; HepG2细胞用RPMI1640培养液培养。

　　1.2.2 DCSIGNGST蛋白的提取、 纯化和鉴定 将含有pGEXKGDCSIGN的菌种BL21于含有氨苄青霉素 (50 mg/L) 的LB培养基中37℃培养。培养到A600为1～2时加入100 mmol/L IPTG（终浓度为0.1 mmol/L）， 诱导融合蛋白DCSIGNGST的表达， 30℃诱导5 h。离心收集诱导后的菌体， 将沉淀重悬于含1 mmol/L PMSF的PBS中， 于冰上超声碎菌后加入200 mL/L Triton X100（终浓度10 mL/L）， 4℃， 轻混1 h。加入GlutathioneSepharose 4B， 室温轻混30 min。将悬浊液收集于4℃， 5 000 g离心5 min， 弃上清。
　　
　　将一部分Sepharose 4B 的悬浊液加入与Sepharose 4B等量的洗脱缓冲液， 室温轻混10 min。 4℃， 5 000 g离心5 min， 收集上清为DCSIGN GST融合蛋白。
　　
　　另一部份Sepharose 4B 的悬浊液以每100 μg蛋白2 U thrombin的比例对结合在层析柱上的融合蛋白进行切割， 23℃， 16 h。5 000 g离心， 收集上清即为DCSIGN蛋白。上述蛋白质进行SDSPAGE检测以及Western blot鉴定， 所用一抗为DCSIGN兔抗人多克隆IgG（效价1∶1 000）， 二抗为HRP标记羊抗兔IgG（效价1∶1 000）。

　　1.2.3 随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成 构建了长度为87nt的ssDNA文库， 两端为固定序列， 中间30个核苷酸为随机序列， 库容量约为1014～1015。两个引物中分别含有EcoR I和BamH I的酶切位点， 随机ssDNA文库和引物由上海生物有限公司合成。随机ssDNA文库: 5′GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCCN30GGGTCAATGCGTCATA3′。引物1: 5′GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC3′; 引物2: 5′GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC3′。

　　1.2.4 双链DNA（dsDNA）及单链DNA（ssDNA）文库的PCR扩增 每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库， 保存， 并以dsDNA文库为模板上下游引物1∶50不对称扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应条件: 94℃ 4 min， 94℃ 30 s， 56℃ 45 s， 72℃ 1 min 30 s， 25个循环， 72℃ 7 min。97 bp PCR产物用30 mg/L的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后并用胶试剂盒回收纯化， 用于筛选。

　　1.2.5 SELEX筛选 前3轮用NIH3T3DCSIGN细胞作为阳性正筛细胞， 从第4轮开始还加入NIH3T3细胞作为阴性反筛细胞; 每轮筛选所用的ssDNA量均为8 μg， 使用前置于80℃水浴10 min后， 迅速冰浴10 min， 加入到 1×107细胞沉淀中（阳性正筛细胞或阴性反筛细胞）， 取等量筛选缓冲液（2×buffer）悬浮细胞后37℃轻振30 min， 再2 000 r/min 5 min离心。在阳性正向筛选中， 离心后留细胞沉淀， 用1×筛选缓冲液(2×Buffer: 25 mmol/L TrisCl， 50 mmol/L KCl， 200 mmol/L NaCl， 0.2 mmol/L EDTA， 50 mL/L Glycerol， 0.5 mmol/L DTT）洗涤2次后， 再用100 μL灭菌ddh3O重悬细胞沉淀， 并煮沸5 min， 冰浴， 用酚/氯仿（25∶24）抽提法得到ssDNA。在阴性反向筛选中， 离心后留上清， 上清直接用酚/氯仿（25∶24）抽提法得到ssDNA。阴性反向筛选中抽提得到ssDNA， 即为下一轮PCR筛选的模板， 共筛选14轮。

　　1.2.6 亲合力检测 (1)FCM分析: 以0～14轮筛选库的DNA为模板， 用FITC引物2进行不对称PCR， 得到FITC标记的ssDNA适配子库。通过核酸沉淀剂纯化处理后紫外分光光度计定量， 各取4 μg适配子与1×105 NIH3T3DCSIGN细胞37℃避光作用30 min， 洗涤3次， 流式细胞仪检测荧光强度; 并通过DCSIGN抗体和0～14轮适配子库混匀后再与NIH3T3DCSIGN细胞作用， 检测抗体对适配子与细胞结合的抑制。ssDNA适配子结合DCSIGN作用的解离常数计算公式: Y= Bmax X / (Kd +X) 其中Y代表平均荧光强度; Bmax代表所测得的最大荧光强度; Kd 为解离常数; X为所加适配子的浓度。（2）ELISA: 在96孔ELISA板中， 每孔包埋含不同浓度 GSTDCSIGN蛋白（或GST蛋白， 作为阴性对照）的蛋白固定液100 μL， 室温过夜后， 加入封闭液封闭， 接着将等浓度(8 g)的生物素标记的单适配子ZD8加入与包埋蛋白中孵育（37℃， 30 min）， 最后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（HRPstreptavidin）以及底物邻苯二胺显色， 450 nm处测定A值。测定适配子与DCSIGN蛋白结合的剂量相关性。

　　2 结果

　　2.1 GSTDCSIGN蛋白的提取和纯化 将DCSIGNGST蛋白提取纯化后， 经SDSPAGE不连续胶电泳和Western blot， 均在预期Mr (73×106) 附近出现1条诱导表达的蛋白质条带(图1)。

　　图1 DCSIGNGST蛋白的SDSPAGE和Western blot鉴定（略）
　　
　　Fig 1 Analysis of DCSIGNGST fusion by SDSPAGE and Western blot

　　A: SDSPAGE; M: Protein marker; 1: DCSIGNGST protein; 2: GST protein. B: Western blot; 1: DCSIGNGST protein; 2: DCSIGN protein.

　　2.2 DNA文库及筛选产物的PCR扩增 化学合成的起始ssDNA 随机文库， 经不对称PCR扩增后， 将扩增的ssDNA 随机文库加入到表达DCSIGN的NIH3T3DCSIGN细胞进行正向筛选， 以获得特异性与DCSIGN结合的ssDNA适配子， 同时用不表达DCSIGN的NIH3T3细胞进行反向筛选， 用来剔除筛选的ssDNA适配子中可与细胞表面其他成分结合的ssDNA。每一轮筛选中获得的特异性结合DCSIGN的ssDNA适配子通过PCR得到富集， 富集后的ssDNA适配子库做为下一轮筛选的模板进入后续的筛选中。因而在后续的筛选中， 不断有亲合力相对低的ssDNA适配子被淘汰掉， 经过14轮筛选后， 最终获得高亲合力、 高特异性结合DCSIGN的ssDNA适配子。结果显示ssDNA库片段大小在DNA marker分子100 bp附近， 与预期片段大小（97 bp）相符(图2)。

　　图2 不对称PCR扩增的ssDNA库1 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定（略）

　　Fig 2 Analysis of ssDNA aptamers by 1 g/L agarose gel electrophoresis

　　1: Aptamer library pool; 2-10: 1st， 4th， 7th， 9th， 10th， 11th， 12th， 13th， 14th DCSIGN aptamer pool; M: DNA marker.

　　2.3 ssDNA适配子库亲合力检测 经14轮筛选之后， 运用FCM检测各轮筛选的ssDNA适配子库与表达DCSIGN分子的NIH3T3DCSIGN细胞的结合能力（图2）。第0、 1、 4轮ssDNA适配子库结合NIH3T3DCSIGN细胞的能力逐渐增强， 不过由于从第4轮开始， SELEX筛选中引入了阴性反向筛选的过程， 剔除掉了一部分ssDNA， 使得第7轮ssDNA适配子库的结合能力低于第4轮; 从第7轮开始， 10、 12、 14轮ssDNA适配子库与NIH3T3DCSIGN细胞结合能力逐步增强， 其中第14轮ssDNA适配子库结合NIH3T3DCSIGN细胞的结合能力最强， 其结合率达到了26.1％（图3）。第7、 10、 12、 14轮ssDNA适配子库与NIH3T3DCSIGN细胞的解离常数（Kd值）测定也表明第14轮ssDNA适配子库与NIH3T3DCSIGN细胞的亲合力（Kd值为15.16 nmol/L）高于其他的ssDNA适配子库（图4）。

　　2.4 DCSIGN抗体拮抗ssDNA适配子库结合DCSIGN的检测 结果显示随着筛选过程的进行， DCSIGN抗体抑制适配子库与NIH3T3DCSIGN细胞结合越来越明显， 其中抗体对第14轮ssDNA适配子库的抑制效应最为明显（图5）。说明随着筛选轮数的增加， 各适配子库对DCSIGN的亲合力以及特异性越来越强， 运用SELEX筛选方法筛选DCSIGN的ssDNA适配子是有效的。

　　2.5 测序及亲合力检测 将第14轮筛选所得ssDNA库扩增成双链DNA库（dsDNA库）， 克隆到PUC19质粒载体中， 然后转入DH5α中， 随机挑取30个克隆进行测序。结果发现有2个重复克隆序列（命名为ZD8）。应用生物素标记的引物P2将ZD8进行不对称PCR 扩增， 扩增产物变性后通过ELISA方法检测不同剂量的GSTDCSIGN（1～10 g/L）与8 μg生物素标记的ZD8（BioZD8）的结合情况（图6）， 观察ZD8与DCSIGN 蛋白的结合的剂量依赖关系。结果显示， BioZD8结合GSTDCSIGN与对照组比较（BioZD8结合GST蛋白）存在统计学意义（P&<0.05）。FCM分析荧光素FITC标记的ZD8与DCSIGNNIH3T3细胞的结合也呈剂量依赖关系（图7）。MTT实验结果显示所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性（data not shown）。这些数据表明筛选出的ZD8与DCSIGN的结合具有高亲合力和特异性， 可作为进一步用于抑制HIV等感染细胞的候选药物。

　　图3 DCSIGN 适配子库与NIH3T3细胞的结合力（FCM）（略）

　　Fig 3 Binding assay between aptamer pools and NIH3T3DCSIGN cells by FCM

　　图4 适配子库的解离常数（Kd）（略）

　　Fig 4 Dissociation constant of aptamer pools（Kd）

　　图5 DCSIGN 抗体抑制适配子库与NIH3T3DCSIGN细胞的结合（略）

　　Fig 5 Inhibitory effects of the binding rates between aptamers and DCSIGNexpressing cells by antiDCSIGN
aP&<0.05 vs antibody group.

　　图6 ELISA分析单适配子ZD8与DCSIGN蛋白的结合（略）

　　Fig 6 Binding rates between the ZD8 and DCSIGN protein by ELISA

　　aP&<0.05 vs GST+BioZD8.

　　图7 FCM分析ZD8与DCSIGNNIH3T3的结合呈剂量依赖关系（略）

　　Fig 7 Analysis of the binding affinities between ZD8 and DCSIGNNIH3T3 cells by FCM

　　3 讨论
　　
　　DCSIGN所识别的病原体如HIV、 HCV 以及结核杆菌都有其共性， 潜伏期长， 能够感染免疫细胞， 抑制细胞免疫， 能长时间滞留在机体内而导致慢性感染， 因而DCSIGN 可能在病原微生物的慢性感染和免疫逃避中发挥着重要作用［5， 6］。DCSIGN作为病原体攻击的靶点也正在成为人类治疗相应疾病的一个重要切入点。
　　
　　我们应用TECSSELEX以NIH3T3DCSIGN细胞为正筛细胞， NIH3T3细胞为反筛细胞得到能与DCSIGN蛋白特异性和高亲合力结合的ssDNA适配子。这些ssDNA适配子可封闭DCSIGN位点以阻止HIV、 HCV等病原体结合DC细胞， 达到抑制感染、 治疗相关疾病的目的。经过14轮的筛选后通过FCM用FITC标记的各轮适配子库检测它们与NIH3T3DCSIGN细胞的亲合力大小， 结果证实了不同库的FITC标记的适配子与反筛细胞NIH3T3的亲合力无差异; 而随着筛选过程的进行， 适配子特异性渐升， DCSIGN 适配子与NIH3T3DCSIGN结合力增加， 结合能力最强的是第14库， 计算其解离常数说明14库适配子对DCSIGN蛋白具有最高的亲合力。需要指出的是， 虽然用NIH3T3细胞反筛， 但适配子仍有与NIH3T3细胞有一定的亲合力， 而在1～3轮细胞反筛时所得到的适配子库与NIH3T3细胞亲合力相对较高， 可能因为1～3轮并未进行阴性反向筛选， 使得这些库的适配子中含有较多的与NIH3T3阴性细胞结合的非特异性适配子的原因导致。而在各库功能性实验的检测中， 结果显示DCSIGN抗体对14库与NIH3T3DCSIGN结合的抑制性最强， 说明DCSIGN抗体可竞争性抑制适配子与NIH3T3DCSIGN细胞的结合， 证实我们的筛选方法是有效的。我们将结合力最强的第14轮适配子克隆到pUC19中并测序， 在30个克隆中， 我们发现第8和第20个克隆的序列相同（ZD8）。并且通过ELISA技术测定ZD8与DCSIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性， MTT法证实ZD8对肝细胞几乎无毒性。
　　
　　总之， 我们运用CELLSELEX技术首次成功地筛选到高亲和力及高特异性结合DCSIGN的DNA适配子， 为拮抗HIV、 HCV、 结核杆菌的早期诊断和治疗作用开辟了一条新的途径， 对进一步研究DCSIGN相关性疾病的预防、 治疗提供了思路， 有良好的应用前景。

参考文献

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　　［2］ Pan Q， Zhang XL， Wu HY， et al. Aptamers that preferentially bind type IVB pili and inhibit human monocyticcell invasion by Salmonella enterica serovar typhi［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49(10): 4052-4060.

　　［3］ Chen F， Zhou J， Luo F， et al. Aptamer from wholebacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis［J］. Biochem Biophyl Res Commun， 2007， 357(3): 743-748.

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