IL10对大鼠原代肝细胞增殖的影响

　　　　 作者：林羡屏， 黄月红， 郑伟达， 陈运新， 陈治新， 王小众

【摘要】 　　目的: 探讨IL10对体外培养大鼠原代肝细胞增殖的影响。方法: 胶原蛋白酶原位灌流法分离大鼠肝细胞， RTPCR法检测肝内不同细胞标志基因的表达情况， 对比原代肝细胞与大鼠正常肝组织的检测结果， 进行细胞纯度鉴定; RTPCR法检测原代肝细胞IL10和IL10受体α（IL10Rα）的表达情况; 原代肝细胞分3组培养: 正常组（N组）、 对照组（C组）和IL10干预组（I组）; 通过MTT分析、 台盼兰细胞计数以及流式细胞术检测DNA含量等方法， 了解外源性IL10对肝细胞增殖的影响。结果: 细胞鉴定结果显示， 所有的标志基因在肝组织都可检测到有较高的表达， 原代肝细胞虽高表达肝细胞标志基因， 而肝内其他细胞的标志基因则不表达或低表达。RTPCR检测显示原代肝细胞可表达IL10和IL10Rα。台盼兰细胞计数提示IL10干预48 h， I组平均细胞数仅为C组的71.96%（P&<0.05）; MTT检测亦显示IL10干预24、 48 h， I组吸光度值分别为C组的88.41%与90.24%（P&<0.05）; 流式细胞术检测结果表明IL10干预24 h， I组肝细胞峰DNA含量是C组的59.06%， I组较C组降低(P&<0.01)， 甚至低于N组(P&<0.01)。结论: 分离的原代肝细胞纯度较高， 大鼠原代肝细胞表达IL10/IL10R mRNA， IL10抑制大鼠原代肝细胞增殖。

【关键词】 原代肝细胞; IL10; IL10R; 细胞增殖

　　白细胞介素10（interleukin10， IL10）是一种抑制性细胞因子， 具有抗炎症作用， IL10受体α(IL10Rα)介导IL10参与各种各样的效应。IL10对治疗许多肝脏疾病如肝纤维化， 有着良好的应用前景， 动物模型实验已证实外源性IL10具有减轻肝脏炎症损伤和肝纤维化的作用［1-3］。IL10与肝纤维化相关研究的对象， 主要是放在HSC、 KC等细胞， 对肝细胞的研究相对较少; 部分学者从组织学、 血清学水平研究IL10对肝细胞的作用， 针对性不足， 要阐明作用机制还远远不够。基于以往对大鼠原代HSC和肝纤维化的研究［3］， 我们将分离大鼠原代肝细胞， 检测大鼠原代肝细胞IL10/IL10RαmRNA的表达， 流式细胞术检测及MTT实验等方法研究IL10对肝细胞增殖的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 SD大鼠（4只， 雄性， 重250～300 g）， 购自上海实验动物中心; 重组大鼠IL10（深圳晶美生物工程公司）， IV型胶原酶（Sigma公司）， DMEM培养基干粉购自Gibco公司， 小牛血清购自杭州四季青公司， 细胞周期试剂盒购自北京天来生物医学科技有限公司， MTT购自Fluka公司， 台盼兰购自上海捷倍思基因技术有限公司。RNA抽提试剂盒（美国Gentra公司）; AMV逆转录试剂盒由（美国Promega公司）; IL10/IL10Rα引物及相应PCR试剂盒（TaKaRa公司）; 其余引物（生工生物工程公司）， 相应PCR试剂盒（美国Promega公司）; 流式细胞仪（COULTER EPICSXL， Backman公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肝细胞的分离、 鉴定、 培养和冻存 取正常SD大鼠， 采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出肝细胞， 具体操作方法见

参考文献

［4］， PAS染色鉴定显示肝细胞纯度， 台盼兰拒染法计数活细胞比例， 按常规细胞冻存方法， 冻存肝细胞于液氮罐中备用［5］， 使用前培养于含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中。

　　1.2.2 原代肝细胞鉴定 分离得到的原代肝细胞以及新鲜肝组织块， 抽提总RNA， RTPCR法检测肝细胞和肝内其他主要细胞的标志基因表达， 相鉴别的细胞和相应的鉴别标志基因如下， 肝细胞白蛋白、 甲胎蛋白(AFP)和细胞色素P450基因CYP2B1和CYP2B2; 胆管细胞CD19， 内皮细胞CD31， Kupffer细胞CD68［6， 7］， 肝内产胶原细胞如星状细胞前胶原酶I（preCollagenI， PCI）。抽提细胞总RNA、 逆转录、 PCR、 凝胶电泳成像的方法步骤参考［8］; 此外结合原代肝细胞PAS染色观察糖原颗粒， 辅助鉴别。引物序列: Albumin: F: 5′TTGCCAAGTACATGTGTGAG3′; R: 5′GGTTCTTCTACAAGAGGCTG3′; 373 bp. CK19: F: 5′GACTTCCTATAGCTATCGCC3′; R: 5′TCTGGTACCAGTCGCGAATC3′; 359 bp. AFP: F: 5′TGAAATTTGCCACGAGACGG3′; R: 5′TGTCATACTGAGCGGCTAAG3′; 272 bp. CYP2B2: F: 5′GAGTTCTTCTCTGGGTTCCTG3′; R: 5′ACTGTGGGTCATGGAGAGCTG3′; 550 bp. CYP8B1: F: 5′AGCACGCAGAAAGTGCTAGAC3′; R: 5′TGTCCTTGGTGCAGCCAAACA3′; 301 bp. CD68: F: GTTCCCTGTGTGTCTGACC(19 bp); R: CTTGGAGCTGAACACATGG(19 bp) 437 bp. CD31: F: CCCATCGAGGAGCAAGAC(18 bp); R: GAGAGTTCTAGCTTCGGCC(19 bp)　　419 bp. PCI: F: 5′CATCCACAAGCGTGCTGTAGGTG3′; R: 5′TGCCGTGACCTCAAGATGTGCC3′; 466 bp.

　　1.2.3 RTPCR检测IL10/IL10Rα的在肝细胞中的表达 总RNA的提取、 逆转录、 PCR、 凝胶电泳成像， 反应参数为: 94℃/5 min→94℃/30 s→55℃退火/45 s→72℃/45 s; 30个循环， 72℃延伸7 min。引物的序列为: IL10扩增片段长度为141 bp: 上游: 5′CAGACCCACATGCTCCGAGA3′; 下游: 5′CAAGGCTTGGCAACCCAAGTA3′; IL10R扩增片段长度为120 bp: 上游: 5′CCGCTGGATGTCTATCCCAAAC3′; 下游: 5′CAGGACAATGTCTGAGCCTTGCTA3′.

　　1.2.4 肝细胞的干预分组 复苏原代肝细胞， 用含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释， 接种培养板， 50 mL/L CO2培养箱里培养24 h后， 更换培养液， 分为3组: N组加不含胰岛素的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液; C组为对照组， 加含2 mg/L胰岛素的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液; I组为IL10（5 mg/L）干预组， 使用的培养液同C组。培养时间梯度为24、 48、 72 h。实验重复3次。

　　1.2.5 台盼兰拒染法检测IL10对肝细胞增殖的影响 以1×108个/L密度接种原代肝细胞于24孔培养板; 按以上条件分组; 在各时间点， 取相应的细胞用吸管轻吹打成细胞悬液; 细胞悬液9滴移入1.5 mL EP管中， 加入4 g/L台盼兰溶液1滴， 混匀， 在血球计数板上加微量细胞悬液。显微镜下， 按公式: 细胞数/毫升原液＝（4大格细胞数之和/4）×104， 计数细胞密度， 连续计数3次， 取其平均值， 每天每组取3孔计数。以时间为横轴， 细胞数为纵轴， 绘制生长曲线。

　　1.2.6 MTT检测IL10对肝细胞增殖活性的影响 以每孔5×103个细胞接种原代肝细胞于96孔板中， 每列的第1孔不加细胞， 为空白对照孔。实验分组及作用时间如前， 每组每个时间点设7个平行孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养72 h。药物处理后的24、 48、 72 h每组各取7孔加入MTT溶液20 μL， 37℃孵育4 h后弃去孔内培养液， 每孔加入150 μL DMSO溶液振荡10 min， 以空白DMSO孔调零， 在酶联免疫检测仪上测550 nm波长处的每孔吸光度（A）值， 求其平均值。对比不同组别A值差异性， 了解IL10对原代肝细胞增殖活性的影响。

　　1.2.7 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行分析; 均数间比较用方差分析， 数据以x±s表示。

　　2 结果

　　2.1 肝细胞的分离、 鉴定、 培养和冻存 采用胶原蛋白酶原位灌流法分离出大鼠原代肝细胞， 台盼兰计数提示活细胞比例大于90%， 根据细胞形态特点和PAS染色鉴定肝细胞纯度大于95%， 冻存的肝细胞复苏后生长状态良好。

　　2.2 肝细胞的纯度鉴定 PAS染色显示肝细胞胞质呈均匀的粉红色阳性着色。RTPCR显示肝细胞和肝组织均表达Alb、 AFP、 CYP2B1和CYP2B2， 肝组织还表达CD19、 CD68、 CD31， 而原代肝细胞组不表达或低表达CD19、 CD68、 CD31， 有效的验证了所分离的原代肝细胞有较高的纯度（图1）。

　　图1 肝细胞PCR鉴定图（略）

　　Fig 1 PCR characterization of rat primary cultured hepatocytes

　　A: Liver tissue group; B: Primary hepatocytes group.

　　2.3 RTPCR检测IL10/IL10Rα的在肝细胞中的表达 结果显示大鼠原代肝细胞表达IL10/IL10Rα（图2、 3）。

　　2.4 台盼兰拒染法活细胞计数检测IL10对肝细胞增殖的影响 细胞初始接种密度为(10.235±0.342)×107/L， 细胞计数结果见表1。原代肝细胞培养48 h， N组和I组平均细胞浓度分别为C组的88.70%和71.96%（P&<0.05）; 培养72 h， N组和I组平均细胞浓度分别为C组的88.70%和71.96%（P&<0.05）; 这些结果提示IL10具有抑制原代肝细胞增殖的作用。

　　图2 大鼠原代肝细胞IL10 mRNA 的表达（略）

　　Fig 2 Expression of IL10 mRNA in rat primary hepatocytes

　　M: DNA marker; 1， 2: IL10.

　　图3 大鼠原代肝细胞IL10R mRNA 表达（略）

　　Fig 3 Expression of IL10R mRNA in rat primary hepatocytes

　　M: DNA marker; 1， 2: IL10R.

　　表1 台盼兰拒染法活细胞计数检测IL10对原代细胞增殖的影响（略）

　　Tab 1 Tryplan blue cell count of each group

　　aP&<0.05 vs C（control）. N: Normal group; C: Control group; I: IL10 group.

　　2.5 MTT检测IL10对肝细胞增殖的影响 结果显示N、 I组A值均较C组低; IL10干预48 h、 72 h: I组A值分别为C组的88.41%与90.24%; N组A值分别为C组的72.52%与69.51%， 差异有统计学意义（P&<0.05， 图 4）。

　　2.6 流式细胞术DNA含量检测了解IL10对肝细胞增殖的影响 利用流式细胞术检测肝细胞DNA含量(图5)， 横坐标代表了肝细胞DNA的含量， 峰DNA含量变化可代表肝细胞增殖的变化情况。24 h的峰DNA含量， C组较N组升高， I组较C、 N组降低（P&<0.01）。从单组看， N、 C组DNA含量在24 h最高， 48 h则最低， 72 h则又有上升趋势， 可以推断肝细胞体外培养的分裂周期为48 h左右; 72 h以后， 各组间峰DNA含量差异逐渐减小。

　　图4 各组MTT检测对比（略）

　　Fig 4 Comparisons of MTT detection in each group

　　aP&<0.05 vs C（control）. N: Normal group; C: Control group; I: IL10 group.

　　图5 IL10干预24 h流式细胞术检测各组DNA含量图（略）

　　Fig 5 DNA detection via FCM after IL10 interfering 24 h in each group

　　N: Normal group; C: Control group; I: IL10 group.

　　3 讨论
　　
　　肝脏的原位胶原酶灌流方法是目前分离动物原代肝细胞的较成熟的方法。肝脏内肝细胞所占的比例约为60%～80%， 肝脏主要还含有星状细胞、 内皮细胞、 胆管细胞和Kupffer细胞等， 灌流除了可以直接去除残留在肝脏内的血液细胞， IV型胶原酶灌流能消化肝细胞间的胶原框架， 不用剪切、 挤压就可以得到大量游离的肝细胞， 并且得到的肝细胞纯度较普通的分离方法大大提高。
　　
　　采用RTPCR法， 检测肝脏内肝细胞和其他细胞的的标志基因表达， 对比肝组织和原代肝细胞之间标志基因的表达差别， 就可以间接鉴定分离的肝细胞的纯度。肝细胞表达白蛋白、 细胞色素P450和AFP， 前两者表达率高， 后者的表达率约30%， CYP2B1和CYP2B2是细胞色素P450同工酶CYP2的不同亚型， 在肝细胞中表达， 在门脉组织中不表达或低表达; 此外， 胆管细胞表达CD19， 内皮细胞表达CD31; Kupffer细胞表达CD68［6， 7］。我们的实验结果显示， 原代肝细胞和肝组织均表达Alb、 AFP、 CYP2B1和CYP2B2， 肝组织还表达CD19、 CD68、 CD31， 而原代肝细胞组不表达或低表达CD19、 CD68、 CD31， 有效的验证了所分离的原代肝细胞有较高的纯度。
　　
　　以往实验研究表明IL10对大鼠肝纤维化具有良好的治疗作用， 肝细胞是否也能表达IL10/IL10Rα？通过半定量RTPCR检测到了原代肝细胞IL10/IL10R的表达。我们通过胶原酶灌流分离大鼠原代肝细胞， 通过RTPCR的方法， 不但检测到了原代肝细胞中IL10的表达， 还检测到了IL10Rα的表达， 这意味着IL10可能对肝细胞发生作用。于是， 我们通过不同的方法， 研究了IL10对原代大鼠肝细胞的作用。流式细胞术检测DNA含量的结果提示， 胰岛素作为有丝分裂刺激素， 有效的促进了体外培养的肝细胞的分裂与增殖， 肝细胞培养至24 h时， C组峰DNA含量最高; 而至48 h， 其峰DNA含量下降接近50%， 因而估计其肝细胞的分裂周期大约在48 h。培养至24 h时， 对比不同组别， I组肝细胞平均DNA含量是C组的59.06%， 是N组的70.18%， 差别有统计学意义; 以上结果提示IL10能明显抑制大鼠原代肝细胞的增殖， 台盼兰细胞计数、 MTT的检测结果亦支持这一结论。
　　
　　组织学水平的研究报道， IL10促进了再灌注损伤大鼠的肝再生［9］， 在体内复杂的条件下， IL10所产生的是一种综合效应， 与损伤的原因、 程度、 时间与IL10作用的时机、 作用时间长短可能都有关系， IL10的应用可能趋于复杂、 多元化。IL10对肝细胞的作用途径可能是错综复杂的， 其机制还有待进一步地研究。

参考文献

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