作者：张梅， 徐书杭， 徐瑜， 刘翠萍， 茅晓东， 徐宽枫， 刘超
【摘要】 目的: 观察抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在小鼠同种异体胰岛移植后体内的分布特点， 探讨抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞免疫调节可能机制。方法: 构建小鼠同种异体胰岛移植模型。CFSE对抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞标记， 经尾静脉输注。用组织冰冻切片和流式细胞术动态了解CFSE标记的抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞在受体内的分布和增殖变化。结果: 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.57±17.15) d， 较胰岛移植组生存时间(10.6±1.82) d， 差异有统计学意义(P&<0.01)。抗原特异性CD4+CD25+ Treg 细胞在各级淋巴结均有能定居， 但是胰腺淋巴结定居的细胞数量明显多于其他淋巴结。结论: 抗原特异性Treg细胞抑制STZ诱导的糖尿病小鼠的急性移植排斥反应， 细胞抑制功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。
AIM: To observe the distribution and proliferation of the antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T (Treg ) cells and investigate the potential mechanism of antigenspecific CD4+CD25+ regulatory T cells on the suppression of rejection for allogenetic islet transplantation in vivo. METHODS: Antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were generated by the addition of multiple intravenous injections of ICR mice splenocytes in vivo. After labeled by CFSE， 8×105 antigenspecific Treg cells were injected via tail vein with islets transplantation. Homing and distribution of antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were investigated by flow cytometric analysis and immunofluorescence. RESULTS: In vivo， the mean survival time of recipients with islets and antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were (34.57±17.15) days， whereas transplanted islets without Treg treatment survived (10.6±1.82) days in control mice. The transferred antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells were mainly resident in pancreatic node and mesenteric node. CONCLUSION: Allogeneic antigenspecific CD4+CD25+ Treg cells prolong islet graft survival， and draining lymphoid tissue play a key role in the immune response.
【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞; 胰岛/移植; CFSE
胰岛移植是治疗1型糖尿病理想的方法。近年来， 较多研究发现CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)在调节移植免疫中起重要作用［1］。Treg细胞主动免疫调节作用为移植排斥反应的治疗开辟了一条新途径。选择合适的细胞标记物跟踪观察， 对于研究移植后的细胞在体内作用机制具有重要作用。在构建小鼠胰岛移植模型的基础上， 我们将标记荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5， 6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞回输至体内， 以观察细胞在体内的生物学特性， 从而对抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞在同种异体胰岛移植排斥反应的调控机制进行初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级ICR小鼠(雌雄不拘， 体质量25～35 g) 购自江苏省实验动物中心; 清洁级BALB/c ByJ小鼠(雄性， 体质量25～28 g) 购自南京大学模式动物中心(ICR和BALB/cByJ小鼠分别作为移植的供体和受体。无特殊病原菌饲养级饲养)。链脲佐菌素(Streptozotocin， STZ)和Ⅴ型胶原酶购自Sigma公司; 小牛血清购自Hyclone公司; RPMI1640培养液购自Gibco公司; Histopaque分离液购自Pharmacia公司; 胰岛素ELISA试剂盒购自Linco公司; PECy5antiCD3、 PEantiCD4和FITCantiCD25抗体均购自Caltag公司; 小鼠CD4+CD25+T细胞磁珠分离试剂盒购自Miltenyi Biotec公司; CFSE购自Fluka公司; XYH2A 体视显微镜购自上海光学仪器公司; 优越Ⅱ型血糖仪购自Roche 公司; BIORAD2100型激光共聚焦显微镜购自BioRad公司; FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。
1.2 方法
1.2.1 实验设计 STZ诱导糖尿病BALB/cByJ小鼠为受体; ICR小鼠为供体; 实验分为3组: A组: 糖尿病BALB/cByJ小鼠对照组(n=5); B组: 糖尿病BALB/cByJ小鼠胰岛移植组(n=5); C组: 糖尿病BALB/cByJ小鼠胰岛移植联合抗原特异性CD4+CD25+ T细胞组(n=7)。在胰岛移植前经尾静脉回输8×105个抗原特异性CD4+CD25+ T细胞。正常对照组(n=5)。
1.2.2 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞制备 取制备好的ICR小鼠单个核细胞悬液， 加入MMC(25 mg/L)37℃孵育30 min， PBS洗涤2次， 1 200 r/min， 离心5 min， 重悬于PBS液， 调整细胞密度2×1010/L， 分别免疫BALB/cByJ小鼠0.5 mL/次， 尾静脉注射， 每周1次， 连续3周。于第3次免疫后第5天， 分别取出被免疫的BALB/cByJ小鼠的脾脏制备淋巴细胞悬液。MACS法分离CD4+CD25+ Treg细胞［2］。
1.2.3 小鼠胰岛分离 ICR小鼠， 非禁食， 10 g/L戊巴比妥麻醉后手术区消毒， 腹部V字型切口， 结扎近十二指肠端胆总管， 靠肝门近端逆行插入26G静脉注射针。破心放血处死动物。将冷胶原酶溶液从插管处灌注4 mL， 迅速完整的摘取胰腺放入含1 mL冷胶原酶试管中， 于37℃水浴静止消化12～15 min， 在涡流震荡器上震荡10 s， 呈细沙状， 然后放置冰上， 立即加入含100 mL/L 小牛血清的4℃ Hank液， 终止消化。30目不锈钢细胞筛过滤， 去除淋巴结等组织。1 000 r/min， 离心2 min， 弃上清， Hank液洗涤2遍。
1.2.4 糖尿病小鼠模型的制备 BALB/c小鼠， 禁食12 h， 用柠檬酸柠檬酸钠溶液(pH4.5)溶解STZ。按200 mg/kg体质量单剂量腹腔注射， 48～72 h后尾静脉采血， 全血血糖≥16.7 mmol/L， 且出现明显清瘦、 多食、 多饮、 多尿， 且维持1周以上者确定为糖尿病模型建立。
1.2.5 同种异体胰岛移植 10 g/L 戊巴比妥腹腔麻醉， 暴露左肾， 从肾下极沿包膜下间隙游离至上极， 注射分离的新鲜胰岛（500～600个）， 缝合。糖尿病对照组肾包膜下注射30 μL生理盐水。移植后第1周每日测量血糖， 自第2周起每周测量2次血糖。以非禁食血糖&<11.1 mmol/L判定为移植物存活， 移植有效。连续2次血糖＞11.1 mmol/L为移植物排斥， 以出现第1次升高的时间为排斥时间。
1.2.6 CFSE标记抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞并回输 用PBS液调整抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞悬液的密度为1×109/L。加入等体积的CFSE工作液。充分混匀， 37℃孵育10 min。PBS洗涤细胞2次， 1 500 r/min， 离心5 min， 弃上清。重新悬浮细胞于PBS液， 并调整细胞密度为1×109/L 。将CFSE标记的抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞， 经尾静脉注射到受体体内。
1.2.7 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞示踪检测 分别于细胞输注后不同时间点处死取小鼠， 将每组小鼠(n=2)以颈椎脱臼法处死并放血。取小鼠淋巴结、 脾脏， 切除小部分留作组织学检查荧光标记细胞分布， 其余留作流式细胞术(FCM)检查。所有动物不计入生存期观察。
1.2.8 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞体内增殖的检测 制备淋巴细胞悬液， 将分离的受体淋巴细胞重新悬浮于200 μL的PBS液。加2.5 μL PEantiCD25抗体， 4℃， 避光孵育30 min。PBS洗2次， 1 200 r/min， 离心5 min。0.5 mL PBS重悬细胞。流式细胞仪检测。以未进行CFSE标记的细胞为阴性对照， 以CFSE标记的回输前细胞为阳性对照。
1.2.9 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞体内分布的组织学检测 将获取肠系膜、 腹股沟和胰腺的淋巴结迅速放置于OCT包埋剂中， 行冰冻切片术， 切片5 μm厚。在共聚焦显微镜下观察。同时取正常小鼠淋巴结组织做阴性对照。
1.2.10 统计学分析 实验数据以x±s表示。使用SPSS10.0软件分析， 2组间比较采用t检验， 存活率用KaplanMeier分析。P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞延长胰岛移植物存活时间 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞明显延长胰岛移植物存活时间。7只接受8×105个抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞联合胰岛移植的糖尿病小鼠全部在24 h内恢复正常的血糖(&<10 mmo1/L)， 实现了胰岛素的不依赖性。抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞联合胰岛移植组胰岛移植物平均生存期为(34.57±17.15) d， 较胰岛移植组生存时间(10.6±1.82) d， P&<0.01为差异有统计学意义。
2.2 抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞在体内的归巢和增殖 标记CFSE抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞在联合胰岛移植后， 激光共聚焦扫描显微镜观察淋巴结组织切片， 均可见带有绿色荧光的细胞定位淋巴结， 但移植后抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞在体内的分布有所不相同， 胰腺淋巴结和肠系膜淋巴结细胞定植较腹股沟淋巴结多。进一步采用FCM检测法分析了这些细胞在体内的存活状况， 结果显示， 输注前抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞荧光强度最强(图1B)， 在注射后第3天和第7天抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞有分裂增殖现象(图1C、 D)。
图1 CFSE标记抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞体内增殖（略）
Fig 1 Proliferation of the CFSElabeled CD4+CD25+ Treg cells after islet transplantation
A: Negative control; B: Before cell transfer; C: 3 days after islet transplantation; D: 7 days after islet transplantation.
3 讨论
Tregs具有两大生物学功能: 免疫无能性; 免疫抑制性。免疫抑制性则表现在体内和体外对CD4+/CD8+T细胞活化和增殖的抑制［3， 4］。1型糖尿病患者在胰岛移植后， 面临移植排斥反应和自身免疫反应两个难题。CD4+CD25+调节性T细胞由于其主动调节免疫耐受的特性， 有可能在胰岛移植发挥双重作用［5， 6］。文献报道， CD4+CD25+ Treg细胞的这一特殊生物学作用受抗原特异性限制。但是， 这些研究多是采用免疫缺陷或转基因动物模型。因此， 我们试图观察抗原特异性调节性T细胞在以正常小鼠为糖尿病模型的胰岛移植中免疫调节作用。本研究采用供体脾细胞体内输注， 成功获得供体抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞， 并且以此作为细胞疫苗联合同种异体胰岛移植。结果显示， 在不使用免疫抑制剂的情况下， 胰岛联合抗原特异性Treg细胞移植组小鼠， 胰岛移植物存活时间明显延长， 较胰岛移植对照组有明显差异。
为进一步研究抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞免疫抑制可能机制， 本实验利用CFSE染料， 采用FCM和激光共聚焦检测观察对抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞在同种异体胰岛移植后在受体小鼠模型引流淋巴结的归巢分布情况进行初步研究。CFSE是一种非极性分子， 可自由穿透细胞膜并不可逆性偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时， CFSE标记物被平均分配到2个子代细胞中， 故其荧光强度是亲代细胞的一半， 是理想的活细胞荧光标记物［7］。将 CFSE标记的抗原特异性CD4+CD25+ Treg细胞尾静脉移植输注受体体内， 于不同时间点取出不同部位淋巴结做冰冻切片。结果显示， 抗原特异性T细胞通过尾静脉注射进入到受体外周淋巴器官中， 其在受体体内淋巴结的分布是有差异的， 以胰腺淋巴结和肠系膜淋巴结为多。自移植后第3天起始有少量的细胞增殖。提示局部淋巴结组织可能是抗原特异性Treg抑制效应性T细胞， 发挥其功能的主要场所。同种异体胰岛移植排斥反应以细胞免疫为主， 这种免疫反应过程是由Ｔ淋巴细胞介导的， 其中CD4+T淋巴细胞发挥主要作用。研究认为， 在移植后早期， 在淋巴结或脾脏活化的T 细胞或外周血单核细胞、 嗜酸粒细胞受移植物自身释放抗原的趋化， 向移植物游走、 定居［8］。抗原特异性Treg特异性地向引流淋巴结(DLN)归巢， 而识别相同抗原的效应性T和活化后表达的趋化因子、 黏附分子使得其与抗原特异性Treg在体内的迁移、 定位几乎完全一致， 这就保证了Treg能够对反应性T细胞发挥充分的抑制作用。最新的研究资料提示， 在胰岛移植后， Treg能够抑制趋化因子的产生， 从而减少移植物局部白细胞的聚集， 由此延长胰岛移植物的存活时间［9］。虽然尚未涉及Treg与效应性T细胞相互作用的具体机制研究， 但是为下一步研究定居于引流淋巴结的Treg功能提供了依据。
综上所述， 抗原特异性Treg能够抑制STZ诱导的糖尿病小鼠的移植排斥反应， 延长移植物的存活时间。Treg在体内发挥功能与细胞在体内淋巴结的归巢有关。只有归巢到引流淋巴结的Treg才能接触到异体抗原， 抑制和阻止免疫排斥反应的发生［10］。因此， 采用何种方法促进抗原特异性Treg在体内特异性归巢， 促进Treg功能的发挥， 提高胰岛移植的效果， 从而确保其在临床治疗中的实用性和有效性， 将是未来研究的主要方向之一。
参考文献
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