低浓度HBsAg人群临床特征及免疫功能测定分析

　　 作者：成军， 孙长贵， 陈瑜， 许志良， 王国政， 孙关忠， 李晓军

【摘要】 　　目的: 分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者高、 低浓度乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群血清双特异性免疫复合物(TCIC)及外周血淋巴细胞亚群之间的差异， 以了解其临床特征及与宿主免疫功能。方法: 采用捕捉法酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)分别测定44例低浓度HBsAg人群(A组)、 82例高浓度HBsAg人群(B组)、 22例健康体检者(C组)血清TCIC和淋巴细胞亚群， 并进行分析比较。结果: A组90.9%(40/44)分布于非活动期， 以HBsAg/IgGCIC阳性率最高15.9%(7/44)， B组以HBsAg/C3CIC阳性率最高46.3%(38/82); A组血清TCIC阳性率、 (A)值及非活动期的CD3+CD8+均低于B组或相应分期(P&<0.01， P&<0.05)， CD4+/CD8+高于B组相应分期(P&<0.01)。结论: 低浓度HBsAg人群机体TCIC形成和清除能力均较低下， 且存在低剂量诱导的免疫耐受现象。

【关键词】 免疫复合物; 慢性HBV感染; 乙型肝炎表面抗原; 淋巴细胞亚群; 免疫耐受

　　低浓度乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群在感染性疾病诊断中已越来越引起临床实验室及流行病学专家的重视［1， 2］， 低浓度HBsAg的检测与报告给临床实验室带来了新的挑战， 给临床的诊断和治疗带来了新的思考， 在流行病学方面， 低浓度HBsAg感染者在自然人群及慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染人群中的分布、 临床特征、 血清学表现模式、 血清型、 基因型以及宿主的免疫功能与高浓度HBsAg感染者之间存在怎样的差异都值得研究和探讨， 为此我们对慢性HBV感染人群以HBsAg浓度及自然史［3］进行分组研究， 采用捕捉法酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)分别测定血清双特异性免疫复合物(TCIC， 包括HBsAg/IgGCIC、 HBsAg/IgACIC、 HBsAg/IgMCIC、 HBsAg/C3CIC)及淋巴细胞亚群(T细胞亚群、 B细胞、 NK细胞)， 以了解低浓度HBsAg人群的临床特征及宿主免疫功能。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 随机收集日常门诊、 住院患者及体检人群慢性HBV感染者血清标本共148份， 其中低浓度HBsAg血清标本44份(A组， 以卫生部临床检验中心提供的HBsAg定值质控血清5 μg/L为标准， HBsAg含量&<5 μg/L定义为低浓度， 经ELISA筛选后Abbott Axsym免疫分析仪测定低浓度HBsAg含量&<72±6.8S/N， 且经中和试验确证)， 通过随访排除了HBV感染早期或恢复期HBsAg/抗HBs转换阶段出现的低浓度HBsAg标本， 根据自然史［3］分为非活动或低/非复制期(非活动期)40例、 免疫活动期2例、 免疫耐受期2例; 高浓度HBsAg血清标本共82份(B组， HBsAg含量&>79S/N， 非活动期35例、 免疫活动期37例、 免疫耐受期10例); 另收集健康体检者乙肝病毒血清学标志物(HBV M)全阴性标本22份作为对照(C组); 上述所有受检者无其他类型肝炎病毒和HIV感染史， A组、 C组及B组的非活动期和免疫耐受期HBV感染者无保肝、 降酶、 免疫调节剂和抗病毒药物应用史， B组的免疫活动期HBV感染者在治疗前采集标本或近半年内无免疫调节剂及抗病毒药物应用史; 血清标本置于-20℃保存待测， EDTAK2抗凝静脉血标本在2 h内测定。抗人IgG、 IgA、 IgM单克隆抗体(mAb)包被酶标板由北京Sun Biomedical Technology Co.， Ltd提供， 生物素化鼠抗人C3抗体包被酶标板购置美国Adlitteram Diagnostic Laboratories， Inc.， HRP抗HBs(多克隆抗体)及ELISA HBV M试剂由上海科华公司提供， 淋巴细胞亚群试剂购自法国Immunotech公司， 美国Abbott Axsym免疫分析仪及其HBV M配套试剂， 美国BioRad 550型酶标仪， 美国Coulter公司EPICSXL型流式细胞仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血清TCIC测定 参照文献［4］进行操作， 其中结果以HBV M阴性的健康体检者血清吸光度(A)值(x±2s)作为cutoff值来判断阳性例数及记录阳性结果的A值(x±s)。

　　1．2．2 淋巴细胞亚群测定 取EDTAK2抗凝外周血100 μL分别加入10 μL CD3FITC/CD16+56PE/CD19PC5、 CD4FITC/CD8PE/CD3PECy5和同型对照抗体进行标记， 经孵育、 溶血、 洗涤后由专业人员在流式细胞仪上进行CD3+、 CD3+CD4+、 CD3+CD8+、 CD3-CD19+、 CD16+56+百分率测定， CD4+/CD8+比值通过CD3+CD4+、 CD3+CD8+计算获得。

　　1．2．3 统计学分析 A、 B组各分期及C组之间的年龄比较采用中位数χ2检验， 性别、 血清TCIC阳性率及(A)值、 淋巴细胞亚群结果比较分别采用两样本的χ2检验或精确概率法和t检验， 所有数据处理均在SPSS12.01统计软件包上进行。

　　2 结果

　　2．1 临床特点 A组44例低浓度HBsAg人群中(男28例， 女16例， 年龄18～65岁， 中位年龄37岁)， B组免疫耐受期年龄(男6例， 女4例， 年龄3～28岁， 中位年龄14岁)与A组非活动期、 B组非活动期及清除期、 C组之间存在显著性差异(P&<0.05)， 其他各组及分期之间年龄、 性别均无统计学意义(P&>0.05); 低浓度HBsAg人群90.9%(40/44)分布于非活动期， 呈低浓度表现达9个月～8年， 平均1.8年， 其中2例免疫耐受期患者HBV DNA分别达1011copies/L和107copies/L， 2例免疫活动期患者中， 1例HBV DNA达109copies/L， 1例HBV DNA达106copies/L， ALT在50～70 U/L之间， 40例非活动期患者中， 2例HBsAg/抗HBc阳性， 2例HBV DNA达106copies/L; 未发现低浓度HBsAg家族聚集现象及职业差别。

　　2．2 血清TCIC及外周血淋巴细胞亚群测定 对3组人群的血清标本TCIC及外周血淋巴细胞亚群测定结果见表1、 2。

　　表1 血清标本TCIC测定结果（略）

　　aP&<0.05， cP&<0.05 vs非活动期; bP&<0.01， dP&<0.01 vs B组.

　　表2 外周血标本淋巴细胞亚群测定结果（略）

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs非活动期; cP&<0.05， dP&<0.01 vs C组.

　　3 讨论
　　
　　将慢性HBV感染人群以HBsAg浓度及自然史进行分组研究， 对其血清TCIC进行了测定， 结果表明: 低浓度HBsAg组90.9%分布于非活动期(40/44)， TCIC阳性率及A值均明显低于高浓度HBsAg组， 说明了低浓度HBsAg人群机体免疫复合物形成和清除能力低下。
　　
　　免疫复合物是机体复杂免疫反应的特定产物， 是机体免疫状态的反映［4］， 免疫复合物的形成既是清除有害抗原的一种保护性反应(如急性肝炎、 急性自限性肝炎)， 但在一定条件下形成的免疫复合物又是对机体的一种致病因素(如慢性活动性肝炎)， 是引起肝损伤或乙肝慢性化的病理分子基础， 并且TCIC在不同类型的HBV感染中存在异质性和具有不同的病理生理意义［5］， 研究结果表明TCIC阳性率及A值不但在低浓度HBsAg组和高浓度HBsAg组中存在异质性， 同时在低浓度HBsAg组和高浓度HBsAg组之间也存在一定的差异， 这可能是由于B组的非活动期、 免疫活动期、 免疫耐受期相互之间经历过多次转变的结果， 而低浓度HBsAg组则较长时期处于非活动期或在各分期相互之间较少发生转变。
　　
　　通过测定3组人群淋巴细胞亚群发现: 低浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+低于高浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+(P&<0.05)， CD4+/CD8+则相反(P&<0.01); 低浓度HBsAg组非活动期的各淋巴细胞亚群与C组无统计学意义， 而高浓度HBsAg组各分期中部分或全部的淋巴细胞亚群与C组存在显著性差异(P&<0.01或P&<0.05); 结果提示， 低浓度HBsAg组非活动期也存在免疫耐受现象， 我们认为属于低剂量耐受(低浓度HBsAg)， 而高浓度HBsAg组免疫耐受期存在的耐受现象［6， 7］应属于高剂量耐受(高浓度HBsAg)， 高浓度HBsAg组非活动期、 免疫活动期则存在免疫功能紊乱现象。
　　
　　以往对HBV感染者研究的文献大多是以HBV无症状携带者(ASC)、 慢性乙型肝炎(CHB)、 急性乙型肝炎(AH)等临床诊断进行分组研究的， 我们对低浓度HBsAg人群分析发现， 低浓度HBsAg人群(通过随访排除了HBV感染早期或恢复期HBsAg/抗HBs转换阶段出现的低浓度HBsAg)应属于慢性HBV感染范畴， 如果以临床诊断分型则90%以上属ASC(均为HBsAg/抗HBs/抗HBc阳性模式， HBV DNA&<106copies/L)， 10%以下属CHB， 但对照组(高浓度HBsAg无症状携带者， HBsAg/抗HBs/抗HBc阳性模式和HBsAg/HBeAg/抗HBc阳性模式并存， 许多患者HBV DNA&>108copies/L)与研究组相比， 显然还存在除HBsAg浓度差异以外的其他差别， 这样的分组是不科学的、 不合理的， 得出的结论也是不正确的， 因此我们将慢性HBV感染人群以HBsAg浓度及自然史进行分组研究， 则排除了上述的分组构成比差别和其他干扰因素， 结果和结论是准确可靠的。
　　
　　综上所述， 低浓度HBsAg人群是HBV感染、 传播过程中形成的一个特殊的群体， 我们认为低浓度HBsAg的产生并较长时间的存在不仅与机体本身的免疫复合物形成和清除能力低下有关， 还与HBV低抗原浓度诱导机体淋巴细胞(特别是T、 B淋巴细胞)产生完全或不完全的免疫耐受有关(低剂量诱导免疫耐受)［8］， 而且还可能与HBV的分子生物学机制(S基因分型、 变异)有关(另文报告)， 研究低浓度HBsAg人群免疫耐受产生的机制及免疫耐受的打破对HBV的感染、 传播、 清除及预防具有重要的、 特殊的临床和流行病学意义。

参考文献

　　［1］ 成 军， 孙关忠， 陈 瑜， 等. 高低浓度HBsAg血清中7项乙肝标志物的表现模式分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2001， 17(5): 443-444.

　　［2］ 李金明. 感染性疾病血清学检验中应重视对弱反应性标本的确认［J］. 中华检验医学杂志， 2006， 29(7): 577-580.

　　［3］ 中华医学会肝病分会、 感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南［J］. 中华肝脏病杂志， 2005， 13: 881-891.

　　［4］ 刘锡光， 祁自柏， 熊诗松. 肝炎实验室诊断指南［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2004: 88-99.

　　［5］ Michelin MA， Crott LS， Assis Pandochi AI， et al. Influence of the electric charge of the antigen and the immune complex (IC) lattice on the IC activation of human complement［J］. Int J Exp Pathol， 2002， 83(2): 105-110.

　　［6］ 徐志强， 张鸿飞， 杨晓晋， 等. 小儿慢性乙型肝炎外周血T细胞亚群和临床病理关系的研究［J］. 中华实验和临床病毒学杂志， 2004， 18: 124-144.

　　［7］ 田 瑛， 邱志峰， 李太生. 慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者外周血T细胞亚群的变化和意义［J］. 中华医学杂志， 2005， 85(47): 3354-3358.

　　［8］ 林春景， 吴金明. 乙型肝炎病毒感染免疫耐受机制的研究进展［J］. 国际流行病学传染病学杂志， 2007， 34(4): 274-280.