人类自然杀伤细胞发育研究进展

【关键词】 自然杀伤细胞; 发育; 分化; 定向

　　自然杀伤（natural killer， NK）细胞是淋巴细胞的一种亚型， 能够参与机体的固有免疫和适应免疫。人类NK细胞是淋巴细胞循环中的一个重要部分， 约占淋巴细胞的20%， 在脾脏和骨髓占5%～10%， 在其他未发生感染的淋巴器官只有很小的比例（小于1%）。免疫反应早期， NK细胞通过直接溶解靶细胞的方式或通过释放细胞因子募集其他类型白细胞的方式杀伤感染病毒的细胞或发生肿瘤性转化的细胞， 细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte， CTL）与NK细胞有着相似的功能， 也参与以上免疫反应。近20年， T细胞和B细胞的发育过程研究得比较清楚， 但对NK细胞发育的认识仍旧比较局限。近几年， NK细胞发育的研究取得较大进展， 基本阐明了NK细胞的发育部位、 发育阶段以及发育过程中免疫表型的变化。

　　1 NK细胞的发育部位

　　1.1 骨髓的NK细胞发育 NK细胞可以在多个部位发育。胚胎时期， 在骨髓、 肝脏、 胸腺、 脾脏、 淋巴结和肠道均发现NK祖细胞（NK progenitor， NKP）［1］。胎肝内的CD34+CD38+细胞群中包含NK祖细胞， 此细胞只能发育成NK细胞。胎儿胸腺内的CD34-CD5-CD56-细胞群也具有发育成NK细胞的能力， 同时可以发育为T细胞， 被称为具有双向分化潜能的T/NK前体细胞［2］。早期研究已经证实破坏骨髓的微环境能够导致严重的NK细胞缺乏和功能缺失， 因此认为骨髓是NK细胞发育的重要场所。目前， 多数学者认为NKP来源于骨髓， 其免疫表型是CD34+CD56-， 可受干细胞生长因子（stem cell growth factor， SCF）、 kit配体和flt3配体刺激进一步分化为CD34dimCD45RA+Integrinβ7+细胞， 迁移至二级淋巴样组织后在IL2和IL15的刺激下分化成熟为NK细胞［3， 4］。研究表明［5］， NKP生成、 获得特异NK细胞表面标记和部分功能的获得等发育过程均可在骨髓中完成。

　　1.2 胸腺NK细胞发育 小鼠体内实验证实［5， 6］来源于胸腺的NK细胞高表达CD127（IL7受体α链）， 其发育依赖于转录因子GATA3的调节。研究表明［6］， 人类胸腺内同样存在CD127阳性的NK细胞。此外， 人类外周血中CD56brightCD16-的NK细胞表达CD127和GATA3， 而CD56dimCD16+的NK细胞不表达CD127和GATA3。因此， 推测不同NK细胞亚型可能来自于不同的发育部位。

　　1.3 淋巴结和扁桃体NK细胞发育 可能是淋巴结和扁桃体只有不足1%NK细胞的缘故， 这两个器官的NK细胞发育长期以来被免疫学家忽视。Freud和他的同事研究证实［7， 8］淋巴结和扁桃体中的CD34+CD45RA+Integrinβ7+细胞在体外培养时能够发育为CD56brightCD16dim/-的NK细胞。他们根据NK细胞在扁桃体、 淋巴结发育过程中的免疫表型变化将此过程分为5个阶段: 祖细胞阶段、 前体细胞阶段、 不成熟阶段、 CD56brightCD16dim/-阶段和CD56dimCD16bright阶段（图1）。相关研究证实淋巴结和扁桃体内的NKP细胞来自于骨髓［9］。

　　图1 人类NK细胞发育各阶段免疫表型变化模式图（略）

　　2 NK细胞的发育阶段

　　2.1 NK细胞定向分化 NKP来源于造血干细胞（haematopoietic stem cell， HSC）或淋巴样祖细胞(common lymphoid progenitor， CLP)［3］。骨髓中CLP的免疫表型为CD34+CD38-CD7+， 可以分化为T细胞、 B细胞和NK细胞［10， 11］。CD38是淋巴造血系统中HSC和CLP发生进一步分化的标志性分子， 其阴性提示尚未发生定向分化， 而CD38阳性表达则提示已经发生定向分化， 部分研究证实CD34+CD38+CD7+表型的细胞为NKP［3］。所谓NKP是指该细胞有发育为成熟NK细胞的能力， 但是不会发育成其它淋巴细胞系。然而， 由于NK细胞、 T细胞和树突状细胞（dendritic cell， DC）分化早期阶段的分化路径十分相似， 祖细胞在特殊环境或细胞因子的诱导下可能会偏离正常分化轨道， 尤其是T细胞与NK细胞。20世纪90年代初期部分学者提出T/NK前体细胞的假说［12］， 认为此前体细胞可以分别分化为T细胞或NK细胞。Sanchez等［2］通过对胸腺CD3-CD4-CD8-CD34+细胞的培养， 得到成熟的NK细胞和T细胞; 针对胸腺CD3-CD4-CD8-CD5-CD56+细胞进行培养， 只能得到成熟的NK细胞， 而培养CD56-CD5-细胞既能够得到成熟的NK细胞又能得到T细胞， 从而证实CD56+细胞出现于NK祖细胞之后， 并认为存在T/NK前体细胞。研究表明［13］， T/NK前体细胞在不同的微环境或者被不同的细胞因子诱导可以转向不同的分化方向。Freud等［8］的研究证实NK细胞在发育的前体阶段仍可被诱导而向T细胞方向分化， 只有进入不成熟阶段时才不能分化为T细胞。因此， 可能从CLP至NK前体阶段的这一较长的发育空间都属于T/NK前体细胞。

　　2.2 NK祖细胞和前体细胞阶段 研究表明， 人类的NKP包含在CD34+CD38+CD45RA+细胞群［7］， 此细胞群中的CD7+CD10-细胞则更为准确地定向于NK细胞［9］。CD25是IL2受体α， 可以与IL2特异地结合， NK祖细胞阶段和NK前体细胞阶段均表达CD25说明NK细胞的发育需要IL2的刺激。CD117又称为ckit， 是淋巴造血系统早期细胞发育过程中表达的重要标记， 与ckit配体结合后可促进细胞发育， 部分NKP和前体NK细胞表达CD117。NKP向下游分化为NK前体细胞， 此时弱表达CD34抗原， CD16和CD94等成熟的NK细胞标记均未表达， 但可出现小比例的CD56+细胞。研究表明［8， 14］， NK前体细胞群中存在CD117+CD44+细胞， 该免疫表型的细胞同样存在于T前体细胞（图1）。

　　2.3 不成熟的NK细胞 此阶段的NK细胞开始表达粒酶B、 穿孔素和TIA1等细胞毒性颗粒， 但表达量很少， 缺乏杀伤能力［8］。研究表明［15］， 体外培养脐带血的CD34+Lin-细胞可分化为CD56-CD161+细胞群， 该群细胞缺乏细胞毒性和KIR家族受体， 属于不成熟的NK细胞。继续培养时可以分化为CD56+CD161+细胞群。进一步研究表明［3， 8］， 此阶段NK细胞有CD122的表达， 可被IL15刺激发生进一步分化（图1）。CD122是IL2受体β， 可以与IL2和IL15结合， 该抗原标记只表达于NK细胞， 是区别NK细胞与T细胞分化的一个重要标记。

　　2.4 成熟NK细胞 人类成熟的NK细胞有两种类型［16］（图1）: 一种是高表达CD56、 低表达或不表达CD16（CD56brightCD16dim/-）， 占外周血NK细胞的10%; 另一种是低表达CD56并高表达CD16（CD56dimCD16bright）， 占外周血NK细胞的90%。这两种NK细胞的分布与功能有明显的不同， 其中CD56brightCD16dim/-细胞具有较低的细胞溶解能力和较强的细胞因子合成能力; CD56dimCD16bright则相反， 有丰富的胞内穿孔素和较强的细胞毒性。这两种成熟的NK细胞是不是由同一种前体细胞产生或有独自的发育途径， 目前仍不清楚。体外实验表明［17］， 细胞因子刺激CD56dimCD16bright细胞可以下调CD16表达， 上调CD56表达。Huntington等［3］从三个方面阐明CD56brightCD16dim/-细胞是CD56dimCD16bright细胞的前体细胞: 其一， 骨髓移植后短期内病人外周血中CD56bright细胞比例明显增加， 之后会出现下降， 而此时CD16bright细胞比例明显增加; 其二， 通常端粒酶的长度是随着细胞分裂和老化而缩短， 来源于同一个体的CD56dimCD16bright细胞的端粒酶明显比CD56brightCD16dim/-细胞的端粒酶短; 其三， 将CD56brightCD16dim/-细胞移植入NOD/SCID小鼠后， 能够分化为CD56dimCD16bright细胞群。

　　3 NK细胞的双向分化特征
　　
　　2006年， Veinotte等［18］在鼠外周血中发现伴有TCRγ受体的NK细胞亚型， 在胎鼠外周血中占NK细胞的5%， 在成年鼠占1%， 而在裸鼠（无胸腺）无此种NK细胞。因此， 推断伴有TCRγ受体的NK细胞来源于胸腺。在人类目前还未见相似的研究报道。
　　
　　成熟阶段的NK细胞与T细胞免疫表型有一定的交叉。正常的NK细胞中有一小部分细胞表达CD8分子， 但无TCR受体形成 ［17］。CD3ε表达始于NK细胞或T细胞的前体期［12］， 位于NK细胞的细胞浆， 但在NK细胞通常无CD3表面抗原的表达。

　　4 NK细胞发育相关的细胞因子和转录因子
　　
　　CD34+细胞需要多种细胞因子的刺激才能发育成NK细胞， 包括SCF、 Flt3L、 IL7、 IL2和IL15， 其中IL2和IL15是人类NK细胞发育重要的细胞因子［1］。转录因子在NK细胞发育过程中亦十分重要， 比如Id2和Id3在人类CD34+细胞过表达阻止其发育为T细胞、 B细胞或DC细胞， 而促进其发育为NK细胞［19］。抑制Id2缺陷小鼠体内的E47蛋白， 可以补救小鼠的NK细胞发育。说明Id2是通过抑制E47起到促进NK细胞发育的作用。以上研究说明准确的NK细胞定向发育需要多种细胞因子和转录因子的参与［1］。

　　5 NK细胞发育在淋巴瘤研究的应用
　　
　　结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤是一种侵袭性的淋巴造血系统肿瘤， 在我国发病率相对较高， 欧美地区少见。该肿瘤表达NK细胞相关抗原， 偶尔有T细胞抗原的表达并伴有T细胞受体基因重排［20］。虽然该肿瘤已被认识近20年， 但是目前仍不清楚其真正的细胞起源（NK细胞起源或T细胞起源）和其肿瘤细胞的分化阶段。因此， 正常NK细胞的发育研究对于明确结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的分化状态和细胞起源有重要的参考价值。

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