兔抗凋亡蛋白酶活化因子1多克隆抗体的制备、 纯化与鉴定

　　　　 作者：张文， 刘红军， 胡志军， 高琰， 高志涛， 王辉

【关键词】 凋亡蛋白酶活化因子1; 多克隆抗体

　　1997年， Zou等［1］首次从HeLa细胞胞质内纯化和克隆出凋亡蛋白酶活化因子1 (apoptotic protease activating factor1， Apaf1)的cDNA ， 该蛋白质的相对分子质量(Mr)为130。近来研究发现在细胞色素C和dATP存在的情况下， Apaf1可聚集成凋亡体(apoptosome)［2］， 凋亡体负责将半胱天冬酶9酶原蛋白（procaspase9）裂解成半胱天冬酶9（caspase9）， 以及维持caspase9的酶活性， 进一步激活caspase3 而诱导细胞凋亡［2］， 因此Apaf1可被认为是凋亡体的真正核心。为了深入研究Apaf1在细胞凋亡中的重要作用， 我们根据美国NCBI数据库中Apaf1氨基酸的序列， 通过软件分析获得表位序列， 然后人工合成抗原肽， 免疫新西兰家兔制备Apaf1多克隆抗体。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 新西兰大白兔雌性2只(体质量1.9～2.1 kg)， 购自郑州大学实验动物中心。Jurkat E61细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡市中心医院。抗原肽KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose 4B购自美国Pharmacia公司。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司。兔抗人Apaf1抗体购自北京博奥森公司， 酶标羊抗兔IgG抗体、 免疫组化染色试剂盒和Western blot试剂购自武汉博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抗原肽的设计 从美国NCBI网站上获得Apaf1（NM_001160）蛋白的氨基酸序列， 含有1194个氨基酸， 然后将该序列用Proteinlounge网站的peptide finder软件进行分析获得有效的Apaf1抗原肽。

　　1.2.2 多克隆抗体的制备 将合成的Apaf1抗原肽KLH与弗氏完全佐剂混合， 在新西兰兔背部行皮内多点注射， 抗原剂量为每只100 μg/次。2周后以相同方法进行第2次免疫(抗原剂量减半， 弗氏不完全佐剂)， 之后每隔3～4 周加强免疫1 次， 并于加强免疫后7～10 d采血， 用ELISA法测定血清中抗体的效价。最后1 次免疫后8 d， 颈动脉插管放血， 分离血清， 置-20℃保存备用。

　　1.2.3 多克隆抗体的纯化 取1 g 活化的琼脂糖（CNBR sepharose 4B）加入5 mL的1 mmol/L HCl浸泡30 min， 然后用20 mL 1 mmol/L HCl洗， 最后用35 mL的0.1 mol/L pH9.0 NaHCO3-0.5 mol/L NaCl洗。将处理好的琼脂糖和20 mg抗原在7 mL 0.1 mol/L pH9.0 NaHCO3-0.5 mol/L NaCl液中混合偶联， 4℃缓慢搅拌过夜。将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内， 将1.5 mL血清中加入6 mL 0.1 mol/L， pH8.0 的PBS， 然后上柱， 用0.01 mol/L pH8.0 PBS液洗柱， 流速为1 mL/min。最后加0.1 mol/L ph3.8甘氨酸HCl缓冲液， 洗脱， 收集解吸附下来的成分， 立即以1 mol/L NaHCO3中和， 以免蛋白变性。将收集液用0.01 mol/L pH7.4 PBS（含0.2 g/L NaN3）透析过夜。

　　1.2.4 多克隆抗体的特性鉴定 ①效价测定:　 采用间接ELISA 法。以合成的Apaf1抗原肽(2 mg/L) 包被ELISA 板， 每孔加入100 μL， 4℃过夜。用洗涤液洗3 次后， 加入10 g/L BSA室温封闭4 h。甩干后， 依次加入倍比稀释的兔抗血清(37℃ 30 min， 洗5 次)、 1∶10 000 的HRP羊抗兔IgG(同上孵育及洗涤)。最后加TMB 底物液显色， 终止反应后， 读取A450值。②Western blot 参照文献［3］取培养的Jurkat E61细胞， 裂解提取蛋白进行SDSPAGE电泳， 然后转移至硝酸纤维素滤膜上， 以50 g/L脱脂奶粉室温封闭后， 分别依次滴加1∶2 000的纯化兔抗Apaf1抗体、 阳性对照抗体（购买的Apaf1抗体）及1∶10 000 的HRP羊抗兔IgG。最后加入化学发光试剂， 用X线片显影、 定影。③免疫组化:　取食管癌组织进行石蜡包埋、 切片， 50 g/L BSA封闭， 然后滴加1∶500稀释的纯化兔抗Apaf1抗体、 阳性对照抗体和免疫前的兔血清， 4℃过夜， 其余按照试剂盒说明操作。最后苏木素轻度复染， 封片。显微镜观察。

　　2 结果

　　2.1 Apaf1抗原表位分析结果 通过软件分析获得5条抗原表位多肽， 长度均为15个氨基酸（表1）。 其中以40EEKVRNEPTQQQRAA54为最佳， 便合成此段多肽与载体钥孔戚血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)偶联成完全抗原进行免疫。

　　2.2 抗血清亲和层析纯化结果 图1所示为1.5 mL血清用Apaf1多肽纯化的亲和层析图， 血清上柱后静置25 min， 然后用PBS洗柱至基线后， 再用甘氨酸HCl洗脱和收集Apaf1的特异抗体。