LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

　　　　 作者：梁璇， 南克俊， 李春丽， 姚煜， 田涛， 王淑红

【摘要】 　　目的: 探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法: 应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区， 利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNALKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞， 经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆， Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化， 流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果: 成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系， 与转染空白载体组比较， 转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢， 细胞周期中G1/G0期比例明显增加， S期比例减少， 细胞凋亡率升高; 同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。 结论: LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。
　　AIM: To determine the effects of exogenous LKB1 gene on biological behavior of lung carcinoma cells. METHODS: Nest PCR was used to clone LKB1 gene pcDNALKB1 and pcDNA3.1 were introduced into A549 cell line by lipofectin transfection， and the A549 cells stably expressing LKB1 gene were established by G418 selection. The expression of LKB1 and STAT3 protein was detected by Western blot. Cell proliferation was observed by growth curve and clone formation. Cell cycle and apoptosis were assayed by flow cytometry(FCM). RESULTS: A549 cells stably expressing LKB1 protein were established. Compared with the vector transfected cells， the positive clone cells grew more slowly. FCM showed that more positive clone cells went into phase G0/G1 and fewer cells went into phase S. Moreover， there was significant difference on apoptosis between the two group cells. CONCLUSION: LKB1 protein might inhibit malignant biological behavior of A549 cells partly by downregulating the tyrosinephosphorylated level of STAT3 protein.

【关键词】 LKB1; 转染; 增殖; 凋亡; 肿瘤; STAT3

　　LKB1/STK11 (serine theronine protein kinase 11) 基因是一种丝氨酸/苏氨酸激酶编码的蛋白， 于1998年首次在PeutzJeghers肿瘤综合症（PJS）患者中发现， 其胚系突变是PJS患者的主要致病因素， 也是易于罹患肿瘤的重要遗传学基础［1-3］。LKB1作为抑癌基因， 可能在肺癌的发生发展过程中发挥着重要作用， 但其机制尚未明确。为了对LKB1的功能进行更深入的研究， 我们以不表达LKB1蛋白的肺腺癌细胞株A549为研究对象， 成功地建立了表达外源性LKB1基因的细胞模型， 针对获得性表达外源性LKB1基因后A549细胞的生物学行为进行了研究， 进一步探讨其可能的作用机制， 为临床防治提供一定的线索。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 TRIzol、 逆转录试剂盒、 OptiMEMI培养基、 转染试剂Lipofectamine 2000、 G418购自Invitrogen公司; 质粒提取试剂盒购自Promega公司; 蛋白裂解液购自PIERCE公司; 鼠抗人His*Tag单克隆抗体(mAb)购自Novagen公司; 鼠抗人actin抗体、 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠、 羊抗兔二抗购自北京中杉试剂公司; 兔抗人STAT多克隆抗体购自Santa Crus公司; 预染蛋白质分子量标准、 限制性内切酶、 T4 DNA Ligase购自New England Biolabs公司; 感受态大肠杆菌DH5α购自北京博大泰克公司; pcDNA3.1载体由北京军事医学科学院二所四室馈赠; DNA合成及序列测定由北京奥科生物有限公司完成。肺腺癌细胞株A549由本实验室保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 LKB1基因克隆与真核表达载体的构建 本实验采用巢式PCR技术， 以人胎脑cDNA文库为模板， 行2次PCR后获得LKB1基因的编码区序列(1 346 bp)。相应引物序列及PCR反应条件为: 初级上游引物5′TGGAGAAGGGAAGTCGGAACA3′， 初级下游引物5′GGGCTGCGAAGTCAACAA3′， 次级上游引物5′ACTCGAGACCATGGAGGTGGTG GACCCGCAG3′， 次级下游引物5′GCGAAGCTTGGCTGCTGCTTGCAGGCCGACAG3′; 94℃变性5 min后进人20个PCR循环(94℃10 s， 60℃ 10 s， 72℃ 90 s)72℃ 7 min， 4℃保存。10 g/L琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物。PCR产物纯化后与pcDNA3.1质粒用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切、 连接、 转化DH5α感受态细胞， 挑菌测序。

　　1.2.2 表达外源性LKB1基因肺癌细胞模型的建立 按试剂盒提取纯化pcDNALKB1和pcDNA质粒， 定量后按照Lipofectamine2000的说明书转染A549细胞。转染24 h后按1×105个细胞接种于60 mm的培养皿中， G418（600 mg/L）筛选阳性克隆， 每3 d更换1次培养液， 16 d左右有克隆形成。挑取单克隆进行扩增， 以G418（300 mg/L）维持， 提取总蛋白行Western blot检测LKB1基因的表达。

　　1.2.3 Western blot检测LKB1蛋白表达水平 提取细胞总蛋白后考马斯亮兰法行蛋白定量; 120 g/L SDSPAGE胶分离蛋白样品， 电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素膜。50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h; TBST(50 mmol/L TrisHCL， pH7.5， 9 g/L NaCl， 1 g/L Tween20)分别稀释His*Tag一抗(1∶1 000)和STAT3磷酸化抗体(1∶800) 4℃过夜; TBST洗膜4次; TBST稀释二抗室温45 min， 洗膜3次， 化学发光法显色。

　　1.2.4 细胞生物学行为的检测 (1)细胞生长曲线: 将pcDNALKB1克隆和阴性对照细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 细胞计数后以每孔5×103接种于24孔板中， 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中常规培养。每天计数细胞3个复孔， 连续8 d， 实验重复3次， 取3次的均数绘制细胞生长曲线。（2）克隆形成试验: 取对数生长期的细胞， 胰酶消化后制备细胞悬液并计数细胞， 按1×103/60 mm培养皿接种细胞， 设3复皿， 常规培养、 换液， 12 d后有克隆形成， Gimsa染色， 体视镜下计数。细胞克隆的标准为≥50个细胞的细胞团计数为一个克隆， 实验重复3次。 （3）细胞周期及凋亡检测: 阳性克隆及阴性对照细胞生长至70%～80%密度时， 收集细胞， 4℃预冷的700 mL/L乙醇固定24 h， RNase 37℃孵育30 min， 加入PI染液室温避光孵育30 min， 用流式细胞术（FCM）检测细胞周期变化， 每标本检测105个细胞， 实验重复3次。Annexin V和PI双染法参照试剂盒的说明书进行: 调细胞密度约109/L， 取480 μL细胞悬液， 加入10 μL Annexin VFITC和10 μL PI混匀， 室温下避光孵育15 min， 以FCM检测分析细胞的凋亡和坏死。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行统计分析。计数资料结果用x±s表示， 两均数的比较用t检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 LKB1 基因的扩增及鉴定 初级PCR产物在约1 900 bp处有条带， 但其下游有杂带（图1A）。将初级PCR产物稀释后行巢式PCR， 在1 300 bp处有明亮条带， 无杂带， 阴性对照组未见条带(图1B)， 提示采用巢式PCR成功扩增了LKB1基因片段。

　　图1 LKB1基因的PCR产物鉴定（略）

　　Fig 1 Electrophoresis of PCR product of LKB1 gene

　　A: Foundamental PCR for LKB1 gene; B: Nest PCR for LKB1 gene. M: DL 2 000 DNA markerr; 1: LKB1 gene PCR product; 2: Negative control.

　　2.2 表达外源性LKB1基因的细胞模型的建立 将pcDNALKB1质粒和空白质粒转染A549细胞， 经G418筛选后得到稳定表达的1、 2、 3号克隆， Western blot检测LKB1基因的表达情况。结果显示转染阳性质粒的克隆株细胞的LKB1基因表达水平明显增高， 其中3号克隆株效果最明显（图2）。因此后续实验选用3号克隆株细胞。

　　图2 Western blot检测不同克隆细胞株中LKB1的表达情况（略）

　　Fig 2 Western blot analysis of the expression of LKB1 gene

　　1: No.1 cell lines; 2: No.2 cell lines; 3: No.3 cell lines; 4: Negative control.

　　2.3 LKB1基因表达对肺癌细胞生物学行为的影响

　　2.3.1 LKB1获得性表达后细胞的生长曲线 稳定转染pcDNALKB1质粒的3号细胞株和对照细胞的生长曲线表明获得性表达外源性LKB1基因的肺癌细胞的生长、 增殖能力明显受到抑制， 其增殖速度明显低于对照细胞（图3）。

　　图3 肺癌细胞获得性表达LKB1基因后的生长曲线图（略）

　　Fig 3 Growth curve of the lung carcinoma cells treated by pcDNALKB1

　　2.3.2 细胞克隆实验 观察细胞克隆形成并对比， 转染空载体的A549细胞生长迅速， 细胞集落大， 数目多， 克隆形成率为（37.0±6.4）%， 稳定转染pcDNALKB1的A549细胞生长相对慢， 所形成的细胞集落小， 细胞数目少， 克隆形成率为（23.0±5.7）%， 转染了pcDNALKB1质粒的A549细胞的克隆形成率明显低于转染空质粒的A549细胞（P&<0.05， 图4）。

　　图4 细胞克隆形成率比较图(P&<0.05)（略）

　　Fig 4 Clone formation rate difference between pcDNALKB1 and vector control(P&<0.05)

　　2.3.3 FCM检测 稳定转染pcDNALKB1后A549细胞的G0/G1细胞比例为77.84%， 对照组(NC) G0/G1期细胞占65.36%， 阳性克隆组的G0/G1期细胞的比例高于对照组， 两组细胞的凋亡率存在统计学差异（P&<0.05， 图5， 表1）。

　　图5 FCM 分析获得性表达LKB1基因对A549细胞细胞周期和凋亡的影响（略）

　　Fig 5 Cell cycle and apoptosis of A549 cells treated by pcDNALKB1by FCM analysis

　　表1 LKB1基因对A549细胞周期及凋亡的影响（略）

　　Tab 1 Effect of LKB1 on the cell cycle and apoptosis of A549 cells

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.3 表达外源性LKB1对A549细胞中STAT3酪氨酸磷酸化水平的影响 pTyrSTAT3蛋白Mr为90 000， Western blot结果显示， 阳性克隆组细胞的 pTyrSTAT3蛋白表达量显著低于对照组细胞（P&<0.05， 图6）。

　　图6 转染LKB1后STAT3酪氨酸磷酸化水平的变化（略）

　　Fig 6 Changes of tyrosinephosphorylated STAT3 level in LKB1 transfected A549 cells

　　1: Negative control; 2: No.3 cell lines.

　　3 讨论
　　
　　LKB1基因是一种抑癌基因， 其野生型的等位基因缺失可导致LKB1基因的失活性表达， 这与错构瘤性息肉的发生和此向腺瘤和癌变的发展密切相关［4-6］。研究表明， 用基因转染的方法恢复和添加肿瘤细胞中失活或缺失的抑癌基因对肿瘤细胞可产生一定的抑制作用， 这依赖于外源基因的高效稳定的表达。本实验中我们应用巢式PCR扩增了LKB1基因片段， 构建并获得了稳定表达外源性LKB1的肺癌细胞株， 经Western blot检测证实其获得了目的基因的肺癌细胞株其LKB1蛋白的表达是显著增强的。
　　
　　肿瘤属于一种细胞周期性疾病， 其生物学行为与细胞周期的变化密切相关。本研究显示获得性表达LKB1基因能明显抑制A549细胞的异常增殖。结合流式细胞术分析发现， 细胞周期中G1/G0期比例明显增加， S期比例减少， 同时凋亡细胞比例增加。提示LKB1基因可使细胞阻滞于G0/G1期， 阻碍或延缓细胞DNA 的合成， 加速细胞的凋亡， 使细胞的增殖受到明显抑制。细胞周期能否启动进入细胞增生主要在于能否通过G1/S检测点， 可见顺利通过G1/S 检测点对于细胞的增殖十分重要。同时， 与转染空载体的对照组细胞比较， 转染入目的基因的细胞体积增大， 细胞为较长的梭状， 其克隆形成能力明显减弱， 细胞生长速率减慢， 细胞数目减少。细胞克隆形成实验反映了细胞的增殖能力和群体依赖性， 它间接反映了肿瘤细胞的恶性程度［7］。LKB1抑癌基因的缺失表达可促进肺癌细胞的过度增殖， 一旦抑癌基因发生改变而不能正常表达时， 细胞增殖的负调控机制失衡， 从而为癌细胞失控性增殖提供了一个有利条件; 而获得性表达LKB1基因促进了其对A549细胞的负性生长调节作用。
　　
　　为了进一步了解LKB1对肺腺癌细胞增殖的调控作用机制， 我们检测了转染后STAT蛋白的磷酸化表达水平， 发现pTyrSTAT3的表达明显受到抑制。信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription， STAT)的表达产物STAT 蛋白在多种肿瘤中表达， 其中STAT3与肿瘤的关系最为密切， STAT3的下游靶基因如Bcl2， Mcl1， cyclinD1， cmyc、 Fas、 VEGF等参与调控细胞增殖、 凋亡、 恶性转化等多种生物学行为。Mukohara等［8］发现在非小细胞肺癌中， 约58%标本中存在STAT3过度活化， 细胞因子通过STAT信号途径诱导下游基因表达， 其表达产物通过抑制STAT酪氨酸磷酸化过程负性调控肿瘤相关的信号通路。这一结果说明， LKB1蛋白可能通过抑制STAT3酪氨酸磷酸化过程， 从而达到抑制肺癌细胞生长的作用， 这为肿瘤的基因治疗提供了一个新的思路和方法， 但对于LKB1蛋白抑制STAT3具体是通过何种途径来调节细胞的增殖活性， 是否存在其它的作用机制， 还有待于进一步研究。

参考文献

　　［1］ Hemminki A， Markie D， Tomlinson I， et al. Serine/threonine kinase gene defective in PeutzJeghers syndrome［J］. Nature， 1998， 391(6663): 184-187.

　　［2］ Fernandez P， Carretero J， Medina PP， et al. Distinctive gene expression of human lung adenocarcinomas carrying LKB1 mutations［J］. Oncogene， 2004， 23(29): 5084-5091.

　　［3］ McGarrity TJ， Amos C. PeutzJeghers syndrome: clinic pathology and molecular alterations［J］. Cell Mol Life Sci， 2006， 63(18): 2135-2144.

　　［4］ Marignani PA. LKB1， the multitasking tumor suppressor kinase［J］. J Clin Pathol， 2005， 58(1): 15-19.

　　［5］ 丁新民， 徐勤枝， 周平坤. LKB1基因功能与肿瘤关系研究进展［J］. 国外医学·肿瘤学分册， 2004， 31(10): 731-735.

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　　［7］ Parris GE. The role of viruses in cell fusion and its importance to evolution， invasion and metastasis of cancer clones［J］. Med Hypotheses， 2005， 64(5): 1011-1014.

　　［8］ Mukohara T， Kudoh S， Yamauchi S， et al. Expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and downstreamactivated peptides in surgically excised nonsmallcell lung cancer (NSCLC)［J］. Lung cancer， 2003， 41(2): 123-130.