Neuropilin1+T细胞与CD4+CD25+调节性T细胞的比较

　　　　 作者：裴向克， 蔡明， 周鸿敏， 刘畅， 徐利军， 陈忠华， 石炳毅

【摘要】 　　目的: 分析Neuropilin1+T细胞(Nrp1+T细胞)与经典CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的关系并比较二者的免疫调节作用。方法: 流式细胞术分析BALB/c小鼠脾脏T细胞上Nrp1与CD4、 CD25的表达关系并分选Nrp1+T细胞及CD4+CD25+Treg， 通过B16F10lucG5黑色素肿瘤细胞体外培养实验并利用萤光成像系统， 观察比较两种细胞对NK细胞杀伤B16F10lucG5黑色素瘤细胞的影响。结果: CD4+CD25+Treg中表达Nrp1的比例为(27.28±1.17)%， 明显高于CD4+CD25-T细胞的(1.63±0.08)% (P＜0.01); 在体外实验中， Nrp1+T细胞与CD4+CD25+Treg均能抑制NK细胞杀伤B16F10lucG5黑色素瘤细胞， Nrp1+T细胞组的肿瘤细胞数目在6、 24、 48、 72 h分别为984±15、 1015±14、 1261±21、 1323±38， 高于CD4+CD25+Treg组的931±4、 983±8、 1201±18、 1256±18， 两组肿瘤细胞数目在各时间点均有统计学意义(P＜0.01)。结论: 经典CD4+CD25+Treg中表达Nrp1的细胞比例较高， Nrp1+T细胞有负性免疫调节作用， 抑制功能比CD4+CD25+Treg更强， 可以作为一类新的Treg亚群。

【关键词】 Neuropilin1; 调节性T细胞; 萤光成像

　　［Abstract］ AIM: To analyze the relationship between Nrp1(neuropilin1) positive T cells (Nrp1+T cells) and CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+Treg) and compare their immunoregulatory effects. METHODS: The expression of Nrp1， CD4 and CD25 on the splenic T cells of BALB/c mice was detected by flow cytometry and Nrp1+T cells and CD4+CD25+Treg were sorted. Then their effects of on NK cells killing B16F10lucG5 melanoma cells were compared in vitro by bioluminescence imaging system. RESULTS: The expression of Nrp1 on CD4+CD25+Treg was (27.28±1.17)%， which was significantly higher than that (1.63±0.08)% on CD4+CD25- T cells(P＜0.01). Both Nrp1+T cells and CD4+CD25+Treg inhibited the effect of killing NK cells on B16F10lucG5 melanoma cells in vitro. At 6， 24， 48 and 72 h， the number of tumor cells in Nrp1+T cell group was higher than that in CD4+CD25+Treg group(984±15 vs 931±4， 1015±14 vs 983±8， 1261±21 vs 1201±18 and 1323±38 vs 1256±18， respectively). There was significant statistical difference between the two groups at each time point (P＜0.01). CONCLUSION: The proportion of CD4+CD25+Treg expressing Nrp1 is high. Nrp1+T cells show negtive immunoregulatory effect， which is more powerful than CD4+CD25+Treg. Nrp1+T cells may be regarded as a new subgroup of Treg.

　　［Keywords］Neuropilin1; regulatory T cell; bioluminescence imaging

　　［摘 要］ 目的: 分析Neuropilin1+T细胞(Nrp1+T细胞)与经典CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的关系并比较二者的免疫调节作用。方法: 流式细胞术分析BALB/c小鼠脾脏T细胞上Nrp1与CD4、 CD25的表达关系并分选Nrp1+T细胞及CD4+CD25+Treg， 通过B16F10lucG5黑色素肿瘤细胞体外培养实验并利用萤光成像系统， 观察比较两种细胞对NK细胞杀伤B16F10lucG5黑色素瘤细胞的影响。结果: CD4+CD25+Treg中表达Nrp1的比例为(27.28±1.17)%， 明显高于CD4+CD25-T细胞的(1.63±0.08)% (P＜0.01); 在体外实验中， Nrp1+T细胞与CD4+CD25+Treg均能抑制NK细胞杀伤B16F10lucG5黑色素瘤细胞， Nrp1+T细胞组的肿瘤细胞数目在6、 24、 48、 72 h分别为984±15、 1015±14、 1261±21、 1323±38， 高于CD4+CD25+Treg组的931±4、 983±8、 1201±18、 1256±18， 两组肿瘤细胞数目在各时间点均有统计学意义(P＜0.01)。结论: 经典CD4+CD25+Treg中表达Nrp1的细胞比例较高， Nrp1+T细胞有负性免疫调节作用， 抑制功能比CD4+CD25+Treg更强， 可以作为一类新的Treg亚群。

　　［关键词］Neuropilin1; 调节性T细胞; 萤光成像

　　调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)是指具有抑制其他免疫细胞功能的负调控细胞， 可分为多种类型， 其中研究最多的是经典CD4+CD25+Treg， 但包括CD25在内， 此种细胞到目前为止仍没有绝对可靠的分子标志。因此， 一些新标志分子如CD127等不断被发现， 神经菌毛素(neuropilin1， Nrp1)也是近年来提出的CD4+CD25+Treg新表面分子标志［1］， 但与之相关的研究甚少。我们对Nrp1+T细胞与经典CD4+CD25+Treg的关系及二者免疫调节作用的比较进行初步探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级雄性BALB/c (h3d)小鼠， 体质量18～20 g， 由华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所实验动物中心提供。萤光素酶（Luciferase）标记的小鼠B16F10lucG5黑色素瘤细胞株（B16F10lucG5 Melanoma Cell Line）及精诺真活体成像系统（IVISImaging System 200）来自美国Xenogen公司; BD FACS Aria流式细胞仪， 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所。PECy5 antimouse CD3单克隆抗体(mAb)， APC antimouse CD4 mAb， FITC　antimouse CD25 mAb， PECy7 NK1.1　antimouse mAb均购自美国eBioscience公司; Neuropilin1 Rabbitantimouse 多克隆抗体及PE Donkeyantirabbit二抗， 英国Abcam公司。小鼠淋巴细胞分离液（EZSepTM Mouse 1×）购自深圳达科为公司， RPMI1640培养基购自美国Sigma公司， 胎牛血清购自杭州四季青公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞的获取 取2只BALB/c 小鼠， 颈椎脱臼法处死， 75 mL/L乙醇浸泡10 min， 超净工作台中无菌开腹、 切取脾脏， 按照达科为试剂公司介绍的研磨方法处理: 在浸于淋巴细胞分离液中的200目尼龙网上研磨脾脏， 研磨出来的淋巴细胞自动扩散入淋巴细胞分离液， 吸取全部研磨液体于15 mL离心管中， 密度梯度离心法(800 g， 30 min)获得云雾状淋巴细胞层， 用非完全RPMI1640洗涤1次后制备成细胞悬液， 显微镜下计数， 台盼蓝拒染法判定细胞活率。

　　1.2.2 抗体标记及Neuropilin1+T细胞、 CD4+CD25+Treg、 NK细胞的分选 将上述淋巴细胞悬液分成两部分: 先取部分淋巴细胞悬液， 按照每管1×106个细胞、 体积100 μL分配至无菌流式上样管中， 按照CD3、 CD4、 CD25的抗体说明书进行标记， Nrp1按照间接标记法进行标记， 标记完成后进行流式分析。剩余的细胞悬液置于15 mL离心管中， 根据细胞计数结果按照抗体说明书先加入Nrp1、 CD3、 CD4、 CD25及NK1.1抗体， 4℃下避光孵育30 min后400 g离心5 min， 弃上清， 同法用PBS洗涤2次， PBS重悬后进行Nrp1二抗标记。标记完成后将淋巴细胞悬液用PBS重悬至1×1010/L的密度， 用BD FACS Aria流式细胞仪分选CD3+Neuropilin1+细胞、 CD3+CD4+CD25+细胞及CD3NK1.1+细胞（NK细胞）， 分选出的细胞置于含100 mL/L胎牛血清的完全RPMI1640溶液中备用。

　　1.2.3 B16F10lucG5黑色素瘤细胞体外培养 取5张96孔板， 每板均分为4组: Nrp1+T细胞干预组(组1)、 CD4+CD25+Treg干预组(组2)、 NK细胞杀伤肿瘤细胞组(组3)及单纯肿瘤细胞组(组4)， 每组均设3复孔， 布板情况相同(表1)。根据预实验， B16F10lucG5细胞每孔加1×103个， 体积为50 μL， Neuropilin1+T细胞、 CD4+CD25+Treg、 NK细胞每孔加2×104个， 体积均为50　　 μL， 用含青链双抗的完全RPMI1640培养液补足至200 μL总体积。取其中1块培养板， 每孔加入15 g/L的萤光素钾2 μL并利用IVIS200成像系统进行光子数检测(1 min， 8bin， FOV12.5， f1)， 其余4块培养板于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养， 分别于培养开始后6、 24、 48及72 h检测。检测结果(光子数)均利用预实验光子数与肿瘤细胞数关系公式计算出相应的肿瘤细胞数。

　　表1 肿瘤细胞体外培养实验分组（略）

　　Tab 1 Group of melanoma cells culture in vitro

　　1.2.4 统计学分析 实验数据经SPSS11.5软件处理后以x±s 表示， 采用方差分析检验各组间差异的显著性。P&<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 小鼠脾脏淋巴细胞获取量 2只小鼠共获得脾脏淋巴细胞约9.0×107个， 细胞活率良好(&>95%)。

　　2.2 Nrp1+T细胞与CD4+CD25+Treg的关系及各细胞分选数量 小鼠脾脏淋巴细胞中Nrp1+T细胞比例为(2.65±0.28)%， CD4+CD25+Treg占(1.51±0.15)%， Nrp1+T细胞占CD4+CD25+Treg的比例为(27.28±1.17)%， 高于占CD4+CD25-T细胞的比例(1.63±0.08)%， 二者差异显著(P&<0.01， 图1-3)。NK细胞占(1.95±0.18)%。最终Nrp1+T细胞分选数量约为7.0×105个， CD4+CD25+Treg约为7.5×105个， NK细胞约9.0×105个， 均能满足实验需要。

　　图1 小鼠脾脏CD4+CD25+Treg比例（略）

　　Fig 1 Proportion of mice splenic CD4+CD25+T cells

　　图2 Nrp1在CD4+CD25+Treg上的表达（略）

　　Fig 2 Expression of Nrp1 on CD4+CD25+Treg

　　图3 Nrp1在CD4+CD25T细胞上的表达（略）

　　Fig 3 Expression of Nrp1 on CD4+CD25-T cell

　　2.3 Nrp1+T细胞与CD4+CD25+Treg 对NK细胞杀伤B16F10lucG5肿瘤细胞调节功能的比较 在肿瘤细胞体外培养试验开始后6、 24、 48及72 h利用IVIS200成像系统检测各组光子数， 并转换成相应的被杀伤肿瘤细胞数， 结果显示: Nrp1+T细胞干预组肿瘤细胞数目在培养后6 h略有下降， 之后缓慢上升， CD4+CD25+Treg干预组、 NK细胞杀伤肿瘤组的肿瘤细胞数目变化具有相同趋势。在6、 24、 48及72 h 4个时间点， Nrp1+T细胞干预组肿瘤细胞数目高于CD4+CD25+Treg干预组及NK细胞杀伤肿瘤组， 均有统计学意义(P＜0.01); CD4+CD25+Treg干预组肿瘤细胞数目高于NK细胞杀伤肿瘤组， 在6 和24 h有统计学意义(P＜0.01及P＜0.05)， 而48和72 h无统计学意义(P＞0.05， 表2)。

　　表2 体外培养实验不同时间检测的B16F10lucG5细胞数目（略）

　　Tab 2 B16F10lucG5 cells number at different time of cell culture in vitro

　　bP＜0.01 vs group 3; dP＜0.01 vs group 2.

　　3 讨论
　　
　　自从Sakaguchi等［2］首次描述CD4+CD25+Treg以来， 其特异性表面分子标志及作用机制等方面一直是免疫学研究的热点。CD25也表达在激活的效应性T细胞上， 因此并不是CD4+CD25+Treg的特异性标志分子。Foxp3可能是目前最好的CD4+CD25+Treg分子标志， 但由于鉴定Foxp3需要细胞打孔， 影响后续功能研究， 寻找新的表面分子标志十分必要。 Nrp1是1995年由Satoda等［3］命名的一种位于神经纤维轴突上的跨膜糖蛋白， 2002年Tordjman等［4］提出Nrp1在树突状细胞及静息T细胞上都有表达并参与树突状细胞诱导静息T细胞激活的过程， 2004年Bruder等［1］首先报道Nrp1可作为CD4+CD25+Treg的特异性表面标志， 其表达与Foxp3具有非常好的相关性。我们亦证实Nrp1与CD4+CD25+Treg关系密切、 具有较好的相关性: Nrp1在CD4+CD25+Treg上的表达显著高于CD4+CD25-T细胞， 但Nrp1+T细胞与CD4+CD25+Treg并不是同一种细胞。
　　
　　CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫中的研究热点， 它在多种恶性肿瘤患者的外周血及肿瘤微环境中均升高并发挥负性免疫调节作用［5， 6］。我们在体外实验中证实， 与CD4+CD25+Treg类似， Nrp1+T细胞也有抑制NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用， 并且Nrp1+T细胞调节组的肿瘤细胞数目在各时间点显著多于CD4+CD25+Treg调节组， 提示Nrp1+T细胞的负性调节作用比CD4+CD25+Treg更强; Nrp1+T细胞负性免疫调节作用持续时间也比CD4+CD25+Treg长， 因为CD4+CD25+Treg调节组的肿瘤细胞数目在48 及72 h与NK细胞杀伤肿瘤细胞组相比已经无明显差异。
　　
　　到目前为止， CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫中免疫抑制作用的机制尚不明了， 可能通过抑制或杀伤CD8+Teff、 CD4+Teff、 NK细胞、 单核巨噬细胞等来发挥负性调节作用， 其机制包括直接接触抑制、 抗原提呈细胞中介、 分泌细胞因子IL10及TGFβ等， 如Sutmuller等［7］发现CD8+T细胞/CTL及CD4+T细胞在小鼠黑色素瘤肿瘤免疫中均发挥重要的杀伤/排斥肿瘤作用， 这两种细胞对于CD25特异性单克隆抗体的抗肿瘤治疗都是必须的， 提示CD4+CD25+Treg可作用于这两种细胞而减弱机体针对肿瘤的免疫反应。Mark等［8］发现Treg可通过TGFβ依赖性途径而非IL10依赖性途径来抑制NKG2D激活的NK细胞杀伤肿瘤的功能， Cai等［9］则发现肿瘤环境中的Treg通过粒酶B及穿孔素依赖性途径诱导NK细胞及CD8+T细胞的死亡。Nrp1+T细胞在肿瘤免疫中发挥负性调节功能也可能通过上述机制。
　　
　　综上所述， 与经典CD4+CD25+Treg相比， Nrp1+T细胞在数量与功能上有新的特性， 可以作为一个新的Treg亚群， 它在免疫学领域的作用必将得到更加深入的研究。

参考文献

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　　［2］ Sakaguchi S， Sakaguchi N， Asano M， et al. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL2 receptor alphachains (CD25). Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases［J］. J Immunol， 1995， 155(3): 1151-1164.

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　　［4］ Tordjman R， Lepelletier Y， Lemarchandel V， et al. A neuronal receptor， neuropilin1， is essential for the initiation of the primary immune response［J］. Nat Immunol， 2002， 3(5): 477-482.

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　　［7］ Sutmuller RP， van Duivenvoorde LM， van Elsas A， et al. Synergism of cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 blockade and depletion of CD25(+) regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses［J］. J Exp Med， 2001， 194(6): 823-832.

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