IL23、 IL17在桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中的表达

　　　　 作者：吴汉妮， 余玲， 屈新才， 钱伟， 肖波

【摘要】 　　目的: 检测桥本甲状腺炎（HT）甲状腺组织中白细胞介素（IL）23、 IL17的表达， 并探讨IL23/IL17在HT免疫病理中的作用。方法: 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和Western blot方法， 检测20例HT患者和15例正常甲状腺组织中IL23p19、 IL17mRNA和蛋白的表达水平。结果: RTPCR显示IL23p19、 IL17mRNA在HT甲状腺组织中的平均表达水平分别为1.0154±0.5749、 0.5952±0.2513， 正常对照组的表达水平分别为0.0929±0.0242、 0.1537±0.0855; 两组比较， HT患者甲状腺组织IL23p19、 IL17mRNA的表达水平显著高于正常对照（P&<0.05）; 且在HT中， IL23p19和IL17mRNA的表达存在正相关（P&<0.01， r=0.861）。Western blot检测显示IL23p19、 IL17蛋白在HT甲状腺组织中的平均表达水平明显高于正常对照（P&<0.05）。结论: IL23、 IL17在HT患者甲状腺组织中的协同过表达， 提示IL23/IL17可能参与了HT的免疫病理过程。

【关键词】 桥本甲状腺炎; 白细胞介素23; 白细胞介素17

　　桥本甲状腺炎（hashimoto thyroiditis， HT）是器官特异性自身免疫性疾病， 确切的发病机制仍未清楚。目前较为一致的观点认为， 在遗传素质与环境因素相互影响的基础上， 机体免疫系统紊乱是导致HT发病的主要原因。传统理论认为， 自身反应性T细胞在HT的免疫机制中起关键作用。近期研究发现， 机体存在一种新的CD4+ T细胞亚型Th17， 产生IL17具有IL23依赖性［1-3］。相关研究表明， IL23/IL17与自身免疫病关系密切［4-6］。本研究拟通过检测HT患者甲状腺组织中IL23p19和IL17的表达水平， 探讨IL23/IL17在HT发病中的作用。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象 2006-03/2007-06在华中科技大学同济医学院甲状腺手术的HT患者甲状腺样本20例（其中男6例， 女14例）， 年龄37～54岁， 平均（44.17±9.33）岁， 均因甲状腺肿出现气管压迫症状或疑诊为甲状腺癌施行手术， 术后病理证实为桥本甲状腺炎。15例甲状腺腺瘤旁的“正常”甲状腺组织作为对照（其中男5例， 女10例）， 年龄35～56岁， 平均（45.33±9.41）岁， 经病理证实无肿瘤细胞的浸润。

　　1.2 方法

　　1.2.1 逆转录聚合酶链反应（RTPCR） 根据GenBank人IL23p19、 IL17的cDNA序列设计引物， 以GAPDH作为内参照。引物序列由上海英俊公司合成: IL23p19: 5′ACAACTGAGGGAACCAAACCA3′， 5′CAGCAGCAACAGCAGCATTAC3′; IL17: 5′GGCTGGAGAAGATACTGGTGT3′， 5′TTTAGTCCGAAATGTAGGCTGT3′; GAPDH: 5′AGTCAGCCGCATCTTCTTTT3′， 5′GAGTCCTTCCACGATACCAA3′。取甲状腺组织， 用TRIzol（Invitrogen公司）提取总RNA， 并逆转录为cDNA（Promega公司）。通过预实验确定各项检测指标的PCR反应条件和最适循环数， 以保证PCR产物量与起始cDNA量呈线性相关。IL23p19、 IL17的PCR反应条件: 94℃ 5 min， 1循环; 94℃ 45 s， 54℃ 45 s， 72℃ 45 s， 35循环; 72℃ 7 min， 1循环; 产物长度均为172 bp。GAPDH: 94℃ 5 min， 1循环; 94℃ 45 s， 53℃ 45 s， 72℃ 45 s， 35循环; 72℃ 7 min， 1循环; 产物长度575 bp。取4 μL PCR产物电泳， SensiAnsys凝胶图像分析系统分析电泳条带的光密度值， 用相对光密度值代表mRNA的表达量。相对光密度值=（IL23p19或IL17光密度值/GAPDH光密度值）×100%。

　　1.2.2 Western blot检测 取甲状腺组织标本， 单去污裂解液提取组织蛋白， 考马斯亮蓝法测蛋白浓度。每例标本取50 μg蛋白样品进行SDSPAGE电泳， 转膜， 然后用含30 mL/L牛血清白蛋白的TBS缓冲液（三氨基甲烷缓冲盐溶液）封闭1 h， 再加兔抗人IL17多克隆抗体（PEPROTECH公司）， 4℃过夜。含2 mL/L Tween的TBS缓冲液洗膜3次， 加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（深圳晶美公司）， 37℃孵育1 h。洗膜3次， ECL显色， 暗室显影。同法检测IL23p19蛋白表达， 所用试剂: 一抗为鼠抗人IL23p19多克隆抗体（美国BIOLEGEND公司）， 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（深圳晶美公司）。以βactin（美国SANTA CRUZ公司）作为内参照。用ImagePro Plus 5.0图像分析软件分析条带的光密度值， 用相对光密度值代表蛋白的表达量， 相对光密度值=（IL23p19或IL17光密度值/βactin的光密度值）×100%。

　　1.2.3 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行统计学分析。所有数据用x±s表示， 两组间均数比较采用独立样本t检验， 显著性水准P&<0.05。相关分析采用Spearman 秩相关分析法分析， 以P&<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 甲状腺组织中IL23p19、 IL17表达水平 与对照组相比， HT组IL23p19、 IL17mRNA和蛋白的平均表达水平均显著升高， 差异有统计学意义（P&<0.05， 表1）。RTPCR电泳图中可见， 对照组和HT组在172 bp处都有IL23p19和IL17条带出现， 但在HT组的表达强度明显高于对照组（图1）。Western blot图中可见， IL23p19和IL17蛋白表达在HT组显著高于对照组（图2）。

　　表1 IL23 p19、 IL17mRNA和蛋白在两组甲状腺组织的平均表达水平（略）

　　aP&<0.05 vs 对照组.

　　图1 IL23 p19、 IL17 mRNA的RTPCR电泳分析（略）

　　M: DNA markers; 1， 2: 对照组; 3-7: HT组.

　　图2 IL23 p19、 IL17蛋白的Western blot分析（略）

　　1， 2: 对照组; 3-8: HT组.

　　2.2 IL23p19和IL17 在HT中的表达相关性 IL23p19和IL17mRNA在HT甲状腺组织中均高表达， 经Spearman秩相关分析， IL23p19和IL17的表达存在显著正相关（P&<0.01， r=0.861）。

　　3 讨论
　　
　　本研究结果显示， IL17和IL23p19 mRNA和蛋白在HT组的表达水平都显著高于正常对照组， 差异具有统计学意义。IL17在HT中的高表达提示甲状腺组织中存在异常活化的Th17细胞。IL23是IL12家族中的一员， 由p40和p19两个亚单位组成， 其中p40与 IL12共用， 而p19是IL23独特的亚单位， 因此p19在HT甲状腺组织中的高表达即IL23异常表达。相关性分析发现在HT组IL17和IL23p19的表达呈正相关性， 提示IL23对HT甲状腺炎症组织中Th17细胞的增殖和存活有重要意义。因此推测， IL23刺激Th17细胞的增殖和维持其存活， 进而Th17细胞分泌IL17可能介导HT的免疫机制。
　　
　　Th17细胞的发现及其在自身免疫性疾病中的重要作用需要重新评价Th1型细胞在自身免疫性疾病中的调节作用。尽管有研究IL23p19缺陷而不是IL12p35缺陷的小鼠可以抵抗胶原诱导的关节炎（CIA）和实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）［7， 8］; IFNγ缺陷鼠或IFNγ受体缺陷鼠无IFNγ信号， 仍可发生自身免疫病， 甚至对自身免疫病更敏感［9］。我们并不能否认IL12及Th1细胞在HT及其他自身免疫性疾病中的重要作用。Bettelli等［10］在EAE的中枢神经系统（CNS）中细胞因子的动态表达证实， 在EAE的高峰期， CNS中有Th17及Th1细胞因子， 而在恢复后明显减少; IL17峰出现在IFNγ之前， 而IFNγ可在靶组织内持续较长时间， 甚至在IL17表达消失后仍有表达。因此认为Th17和Th1可能协同诱导器官特异性自身免疫性疾病， 在疾病的不同阶段发挥作用。且在抗原呈递细胞存在的条件下， IL17可以抑制Th1细胞的分化， 而IFNγ则可抑制Th17细胞的分化［11］。Barin等［12］曾发现IFNγ在自身免疫性甲状腺炎有疾病抑制作用， 认为IFNγ有免疫激活和免疫抑制双重活性， 哪一种活性在优势取决于IFNγ的分泌时间和部位。藉此， 我们推测， Th17可能弥补了Th1介导效应机制的不足， 在HT的炎症反应过程中， Th17和Th1细胞制约平衡可能协同诱导HT的发生发展。Th17比Th1产生快， 启动急性炎症反应， IL23刺激Th17细胞分泌IL17在炎症反应的早期可能发挥主导作用; 而IL12刺激Th1分泌IFNγ在其后维持炎症反应中发挥作用。
　　
　　总之， 本实验表明Th17细胞分泌IL17可能参与了HT的发生发展， 其存活因子IL23在此过程中发挥间接作用， 但Th17细胞在HT甲状腺组织的免疫紊乱中的具体机制及其与Th1可能的协同作用机制尚需进一步的研究。

参考文献

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