TB细胞协作研究的重大突破——滤泡辅助性T细胞的发现, 一个新的CD4+效应T细胞亚群

【关键词】 Tfh; IL21; ICOS; CXCR5; Bcl6

　　二十世纪60年代， Claman和Miller等［1， 2］分别采用照射或胸腺切除的小鼠模型， 同时过继转移正常小鼠骨髓细胞和胸腺细胞， 或过继转移胸腺细胞或胸导管淋巴细胞， 才能产生针对羊红细胞抗体， 发现了B细胞对某些抗原（后称为T细胞依赖抗原）刺激产生抗体必须要有T细胞的辅助。
　　
　　抗体分泌细胞产生于外周淋巴器官（脾脏、 淋巴结、 扁桃腺和派氏集合淋巴结等）生发中心（germinal centers， GC）， 并在那里发生体细胞高频突变、 抗体类别转换和高亲和力的选择。GC也是CD4+辅助性T细胞（Th）直接辅助B细胞的部位， Th对于GC的形成， 选择高亲和力B细胞分化为记忆细胞或浆细胞， 以及维持长时间的体液免疫应答等方面都发挥着关键作用。
　　
　　虽然Th细胞辅助B细胞产生抗体的研究已有40年历史， 但“辅助性T细胞”的真正面貌并不清楚， 一度曾认为认为Th3是T细胞辅助B细胞的主角(图1)。2000年Schaerli和Breitfeld几乎同时报道了一个定位于淋巴滤泡、 具有辅助B细胞功能、 表型为CXCR5+ CD40L+ ICOS+的T细胞亚群， 称为滤泡B辅助性T细胞［3， 4］。2002年Moser等［5］撰写了题为“CXCR5+ T cells: follicular homing takes center stage in Thelpercell response”综述， 并且提出了Tfh可能是不同于Th1和Th3的一个新的T细胞亚群。直到最近才确定， 滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells， Tfh）是主要负责辅助B细胞的T细胞亚群。Tfh上表达的CD40Lhi和ICOShi分别通过与B细胞上CD40和ICOSL结合， 以及Tfh所分泌的IL21， 在刺激B细胞的增殖、 分化以及免疫球蛋白类别的转换中起着十分重要的作用。此外， 表达CXCR5的Tfh在淋巴滤泡处产生CXCL13的趋化下， 被募集到淋巴滤泡并与B细胞共定位和相互作用， 因此， CXCR5成为Tfh迁移、 定位重要的“转运分子”（trafficking molecules）， 也是Tfh细胞重要的表面标志。Bcl6目前认为是可能控制初始T细胞分化为Tfh的转录因子。不难看出， 黏附分子、 细胞因子、 趋化因子和受体、 转录因子以及这些分子基因敲除模型的建立， 为发现和确定Tfh细胞亚群提供了坚实的基础， 从这个意义上来说， 现在确定Tfh为一个新的CD4+效应细胞亚群是“水到渠成”的。

　　图1 T细胞辅助B细胞40年研究历史（略）

　　1 Tfh的来源以及与Th1、 Th3、 Th17和Treg的关系
　　
　　以往认为， Th3细胞通过分泌IL4刺激B细胞增殖和Ig类别转换， 上调B细胞CD40和MHCⅡ类分子的表达， 是辅助B细胞主要的T细胞亚群。实际上， IL4-/-小鼠仍然可产生针对T细胞依赖抗原的抗体［11］。目前已经明确， Tfh是辅助B细胞主要的T细胞亚群， 而Th1和Th3所分泌的细胞因子在B细胞活化和Ig类别转换中只起到调节的作用。
　　
　　初始T细胞表达CCR7而不表达CXCR5， 通过CCR7与相应配体二级淋巴组织来源的趋化因子（SLC）/CCL21结合， 使初始T细胞进入外周淋巴器官的T细胞区［12］。活化CD4+T细胞可一过性表达CXCR5， 因此也具有被迁移到淋巴滤泡的能力， 这一过程与CD28、 OX40和ICOS所介导的信号转导有关， 而且CXCR5表达发生在活化T细胞增殖和分化之前。但是完全极化（full polarized）的Th1和Th3又不表达CXCR5（图2）。
　　
　　在T细胞中有一部分持续表达CXCR5， 主要迁移到B细胞滤泡中， 同时表达ICOShi、 CD40Lhi和分泌IL21， 执行辅助B细胞的功能， 成为滤泡辅助性T细胞。

　　图2 CD4+T细胞亚群的分化与转录因子、 趋化因子受体以及分泌细胞因子的关系（略）

　　有趣的是， Tfh与Th17两个亚群有某些相似之处， 如都表达IL21， 分化发育都依赖于IL6、 IL21和STAT3。但Tfh不产生IL17A、 IL17F和IL22， 其分化也不依赖TGFβ的RORγt转录因子［9］。

　　2 参与Tfh细胞功能的关键分子
　　
　　参与Tfh细胞功能的关键分子见表1。

　　表1 参与Tfh细胞功能的重要分子（略）

　　注: （1）除Tfh外， IL21还可由Th17和NK T细胞产生; （2）在Tfh表达的共刺激分子中， CD40Lhi对B细胞体液免疫功能也有重要调节作用; （3）Tfh表达高水平的IL6R和IL21R， 后者参与Tfh自分泌IL21的功能; 此外Tfh还分泌IL10; （4）Tfh还表达PD1和BTLA等负性调节的共刺激分子.

　　2.1 Bcl6 与Tbet、 GATA3/Stat6、 FoxP3、 RORγt分别决定Th1、 Th3、 Treg或Th17谱系分化不同， 决定Tfh细胞的转录因子目前尚不能完全确定。但多种证据提示， Bcl6(Bcell CLL/Lymphoma 6， zinc finger protein 51)可能发生挥着重要作用。虽然GC中B细胞可表达Bcl6， 但在CD4+T细胞中， Bcl6优先表达于Tfh［13］， 而不表达于Th1和Th3， Bcl6-/-小鼠由于缺乏GC形成， 针对T细胞依赖抗原的抗体应答受损， 抗体亲和力成熟也发生障碍［17， 18］。
　　
　　此外， Bcl6表达还抑制了GATA3表达， 抑制T细胞IL4分泌［19］。Bcl6还可抑制TGFβSmad信号途径， 提示不存在TGFβ可能有利于Tfh的分化［9］。值得注意的是， GC中CD4+T细胞仅有10%～15%表达Bcl6。

　　2.2 IL21 IL21是属于γc依赖的细胞因子（cdependent cytokines）。共用γc（CD132）作为其受体亚单位的细胞因子有IL2、 IL4、 IL7、 IL9、 IL13、 IL15、 IL21以及胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）。IL21 2000年基因克隆成功。IL21主要由Tfh、 Th17和NK T细胞产生， Th1和Th3也可分泌IL21， 但水平较低［13］。由于IL21是Tfh细胞执行效应功能的主要细胞因子， 因此又称为Tfh表达的辅助性细胞因子（Tfhexpressed helper cytokine）。IL21缺陷小鼠Tfh细胞发育障碍。IL21R由结合IL21的IL21R 链和γc组成， 分布广泛， 但主要表达于B细胞、 Tfh、 Th17和NK细胞， 因此上述细胞也是IL21作用的主要靶细胞。

　　2.2.1 IL21对B细胞的调节作用 B细胞是IL21作用的主要靶细胞。当CD40 mAb交联刺激人B细胞时， IL21可使活化B细胞分泌IgG1和IgG3。IL21可诱导所有B细胞亚群（包括新生B细胞、 初始B细胞、 过渡型B细胞、 生发中心B细胞以及记忆B细胞）分化为Ig分泌细胞（Igsecreting cells， ISC）， 分泌大量IgM、 IgG和IgA［14， 20-22］。一般来说， IL4对初始B细胞的作用要明显强于作用于GC和记忆B细胞的作用; 而IL10则优先增强GC 中的B细胞和记忆B细胞分化为ISC。由Tfh产生的IL21， 在B细胞对T细胞依赖抗原的初始免疫应答、 再次免疫应答以及体液免疫长期的维持中都发挥了主要作用［14］。
　　
　　以往认为， IL10是最为重要的刺激人B细胞分化为浆细胞的细胞因子。相比之下， IL21在CD40 mAb刺激人B细胞分化为浆细胞的效能是IL10作用的100倍［14］。CD40 mAb联合IL21刺激人B细胞可诱导其表达酶活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（enzyme activationinduced cytidine deaminase， AID）和B细胞成熟蛋白1（Blymphocyte maturation protein1， Blimp1）， AID和转录因子Blimp1分别在Ig类别转换和B细胞向浆细胞分化中起着关键作用［20］。IL4可通过抑制Blimp1的表达抑制IL21对初始B细胞的刺激作用; 而记忆B细胞则对IL4抑制IL21的作用有抵抗［14］。IL21-/-小鼠B细胞应答水平明显降低。

　　2.2.2 IL21对Tfh的调节作用 Tfh本身也表达IL21R， IL21通过以下几方面调节Tfh: ①诱导Tfh分化， IL21或IL21R缺陷小鼠Tfh细胞数量锐减; ②IL21通过自分泌形式促进Tfh细胞表面CXCR5的表达， 使其向淋巴小结和生发中心迁移， 并在那里与B细胞相互作用， 因此IL21也是GC形成中的关键细胞因子; ③诱导Tfh细胞ICOS表达， 发挥Tfh辅助B细胞的功能（见下述）。
　　
　　IL21R信号转导是通过Vav1调控T细胞受体信号体（T cell receptor signalosome）实现的。Vav1是Rho家族GTPases中一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor， GEF）， 在NFATc1活化中发挥重要作用， 可下调细胞周期抑制物p27kip1水平， 促进IL2产生、 肌动蛋白多聚化和TCR成簇。IL21诱导Vav1中酪氨酸发生磷酸化， 从而增强了TCR信号强度， 有利于Tfh分化［10］。

　　2.2.3 IL21对Th17和NK细胞的调节作用 IL21也是Th17产生和分化的重要的自分泌细胞因子。由于Th17表达CCR4和CCR6而不表达CXCR5， 因此Th17被募集到炎症区域， 而不迁移到淋巴小结。IL21可促进NK细胞的分化， 诱导其产生IFNγ。

　　2.3 ICOS 诱导性协同刺激分子（inducible costimulator， ICOS）是CD28家族中的一个成员， 为T细胞活化所诱导。ICOS基因1999年克隆成功［23］， 2004年命名为CD278。ICOS配体（ICOS ligand， ICOSL）即B7h3（B7 homologue 2）， 命名为CD275。以往认为， ICOS主要表达在Th3细胞。实际上， 形态学上早就观察到ICOS高表达于扁桃体生发中心明区顶部的T细胞。只是那时还没有认识到这群细胞其实主要是Tfh细胞。ICOSL主要表达于包括B细胞在内的APC。

　　2.3.1 ICOSL/ICOS相互作用调节Tfh和B细胞功能 B细胞上ICOSL与Tfh细胞上ICOS相互作用， 对于Tfh细胞的产生和维持， 生发中心和记忆B细胞的形成发挥重要作用［9， 24］。在体外， 来自扁桃腺中CXCR5hiICOShiCD4+细胞可有效诱导B细胞产生IgG［25］。ICOS/ICOSL相互作用对于Tfh表达IL21是必需的， 其机制可能是通过NFATc1来调节IL21表达［9］。纯合子缺乏ICOS与人普通变异免疫缺陷病（common variable immunodeficiency， CVID）有关， 患者淋巴结中GC缺如， IgM+记忆B细胞明显减少， 外周血中CXCR5+CD4+T细胞缺如［9， 10］。

　　2.3.2 Sanroque小鼠品系建立促进了对Roquin蛋白调节ICOS表达的认识 2005年Vinuesa等采用致遗传上发生改变的乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea）处理C57BL/6小鼠， 获得一种具有典型系统性红斑狼疮（SLE）特征的小鼠品系， 称之为sanroque小鼠。在细胞水平上发现， sanroque小鼠淋巴结中有大量的Tfh， 自发形成GC。这种突变小鼠缘于一种ICOS表达的抑制物的缺陷， 从而使Tfh表达高水平的ICOS， 并分泌大量的IL21。进一步研究发现， 导致小鼠发生病理改变的突变基因是编码一种高度保守RING型泛素连接酶家族成员的Roquin（Rc3h1）。Roquin蛋白含有一个结合RNA的CCCH锌指结构， 分布在胞质RNA颗粒， 提示其可能调节mRNA的翻译和稳定性。Roquin是Tfh和自身抗体应答的一种关键负调控蛋白， sanroque小鼠Roquin发生了突变（M199R）， 影响了Roquin 螺旋结构， 不能发挥抑制ICOS表达的作用， 过多形成Tfh， 导致sanroque小鼠发生自身免疫综合征［8］。

　　2.3.3 Roquin抑制自身免疫的分子机制 2007年Vinuesa研究组发现Roquin抑制自身免疫的分子机制是通过限制ICOS mRNA表达实现的。正常情况下， Roquin可通过促进ICOS mRNA降解而限制ICOS表达， 在ICOS mRNA 3′端非翻译区有一个保守的区域， 由47个碱基对组成， 可与T细胞表达的microRNA（包括miR101）相互补。Roquin是否直接结合mRNAs靶分子和/或结合到与靶分子互补的miRNA还不清楚［26］。

　　2.4 CXCR5 CXCR5（CD185）最初被称为BLR1（Burkitt’s lymphoma receptor 1）， 1992年基因克隆成功［27］。其相应的配体为BCA1（B cellattracting chemokine1/CXCL13）［28］。CXCR5主要表达于Tfh和B细胞。

　　2.4.1 Tfh细胞表达CXCR5 初始T细胞不表达CXCR5， T细胞活化后CXCR5可一过性表达， 这种活化依赖于CD28和ICOS等共刺激分子， CXCR5表达往往发生在细胞增殖和分化之前。一般认为， 完全极化的T细胞（如Th1和Th3）不表达CXCR5。在淋巴结中有一部分经抗原活化的CD4+T细胞， 表达高水平的ICOS和CD40L， 并分泌大量IL21， 发育成为Tfh。CD8+T细胞也不表达CXCR5。在活化的淋巴组织（例如扁桃腺）中， 将近50%的CD4+T细胞为CXCR5+， 并定位于生发中心。从扁桃腺中分离出来的CXCR5+CD4+T细胞可有效地辅助B细胞并使其分化为浆细胞。CD4+CXCR5+CD40LhiICOShi成为Tfh细胞重要的表型［29］。

　　2.4.2 B细胞表达CXCR5 在淋巴组织中， CXCR5表达于所有的成熟B细胞。由淋巴滤泡基质细胞（包括滤泡树突状细胞， FDC）所产生的CXCL13趋化因子通过与其相应受体CXCR5结合， 招引B细胞和T细胞定位于淋巴组织的滤泡区域［3， 30， 31］。

　　3 效应Tfh细胞和记忆Tfh的迁移和组织定位

　　3.1 CXCR5与Tfh和B细胞迁移到B细胞区的关系 Tfh表达CXCR5是Tfh迁移到外周淋巴器官B细胞区的关键trafficking分子。此外， CXCR5也表达于B细胞， 参与外周淋巴器官中B细胞滤泡的发育。CXCR5-/-或CXCL13-/-小鼠淋巴小结结构紊乱， 淋巴结和派氏集合淋巴结数量降低［30， 32］。虽然活化T细胞可一过性表达CXCR5， 但在T细胞中只有Tfh持续性表达CXCR5。在GC中， Tfh与B细胞相互作用有利于CXCR5持续表达。实际上， B细胞与效应T细胞的相互作用首先发生在外周淋巴器官的T细胞区。接受抗原刺激后的B细胞有两种命运: 一是迁移到淋巴小结外， 发育分化为浆细胞， 并很快分泌低亲和力抗体; 另一种归宿是同T细胞一起迁移到淋巴小结B细胞区， 并形成生发中心， 发生体细胞突变和抗体亲和力成熟。而且Tfh迁移到B细胞滤泡对GC的发育是必不可少的。
　　
　　初始T细胞表达CCR7和CD62L， 在高内皮微静脉（HEV）产生CCL21趋化下迁移至外周淋巴器官的T细胞区， 接受来自DC的抗原刺激。活化T细胞上调CXCR5， 赋予其迁移到淋巴小结的能力， Tfh细胞在淋巴小结中与抗原刺激过的（antigenprimed）B细胞相遇， 发生CD40CD40L依赖的B细胞的活化。Tfh是否可直接从血液进入淋巴滤泡区尚不清楚(图3)［7， 9］。

　　图3 Tfh细胞的分化、 迁移和组织定位（略）

　　注: （1）由外周淋巴器官T细胞区高内皮微静脉（HEV）产生的SLC（secondarylymphoid tissue chemokine）/CCL21招引表达CCR7的初始T细胞从外周循环进入T细胞区; （2）T细胞与成熟树突状细胞（mDC）等APC相互作用后表达IL6R和IL21R， APC产生的IL6与经抗原刺激后T细胞IL6R结合; （3）活化T细胞表达高水平ICOS、 IL6R、 IL21R和CXCR5， IL6和IL21调节Tfh细胞分化时通过其受体激活STAT3， 表达有CXCR5的Tfh被滤泡基质细胞（包括FDC、 血管细胞和网状细胞）产生的BCA1（B cell attracting chemokine）/CXCL13趋化迁移到淋巴小结， 进一步形成生发中心; （4）高表达CXCR5 B细胞从T细胞区迁移到B细胞滤泡（未显示）， TfhB细胞相互作用， CD40L/CD40和ICOSL/ICOS共刺激分子以及Tfh分泌IL21， 在Tfh辅助B细胞中发挥关键作用; （5）活化B细胞发生增殖分化、 Ig类别转换和亲和力成熟。

　　3.2 记忆Tfh 在外周血T细胞中约有10%为CXCR5+CD4+， 并同时表达CD62L和CCR7， 可能是Tfh来源的记忆性T细胞亚群。探讨Tfh在GC中发生应答后的转归， 与免疫记忆、 疫苗研制和自身免疫性疾病有着密切的关系。目前认为， Tfh是终未分化的T细胞亚群， 由于其高表达CD95， 易于发生凋亡。但是， 最近发现在GC应答消退后， 记忆性CXCR5+CD69+Tfh继续存在于B细胞滤泡局部， 即有一群高亲和力CXCR5+T细胞存在于表达CXCL13 FDC细胞的周围， 当发生再次免疫应答时可被重新活化。显然Tfh的免疫记忆不同于其他T细胞亚群。局部环境的因素与Tfh记忆细胞存在密切相关。在B细胞滤泡中的记忆Tfh细胞还会接受来自B细胞和其他APC细胞的抗原刺激， 但这些刺激的强度尚不足于诱导效应Tfh表达ICOS和IL21的分泌。其他T细胞亚群如效应Th1和CD8+T细胞大都定位于外周的组织和炎症损伤部位， 而效应和记忆的Tfh主要定位于淋巴样组织， 尤其在B细胞滤泡［33］。淋巴滤泡中记忆Tfh细胞还可调节记忆B细胞功能， 使其保持长时间体液免疫应答能力。

　　4 Tfh功能失调与临床疾病发生的关系
　　
　　Tfh功能失调与多种疾病的发生有关， 包括自身免疫性疾病、 免疫缺陷和肿瘤等。

　　4.1 Tfh细胞与自身免疫性疾病 在SLE患者或小鼠狼疮模型中， 阻止CD40CD40L相互作用可预防GC形成和自身抗体的产生， 而且外周血出现大量的GC样B细胞和浆母细胞［34， 35］。发生狼疮的BXSB小鼠过高表达IL21。SLE患者外周血或狼疮小鼠脾脏中ICOS+CD4+T细胞百分率增加。上述结果提示， Tfh细胞在这些病理状态下可能发生了扩增。如果Tfh对自身反应性B细胞产生过强的辅助信号， 可能引起了抗体介导的自身免疫性疾病。
　　
　　在正常情况下， Tfh表达CXCR5， 并定位于淋巴组织中B细胞滤泡中。在发生自身免疫时， Tfh也可迁移到非淋巴组织， 这可能与病损部位产生CXCL13有关。病损部位的Tfh产生大量的IL21， 可能参与和导致了T细胞介导的慢性自身免疫性疾病。人自身免疫病常发生在非淋巴样组织， 病损部位常有大量活化的淋巴细胞浸润， 并形成含有异位GC的淋巴样组织［36］。这些异位GC中的B细胞可能通过体细胞高频突变， 产生高亲和力抗体。
　　
　　TNFα和LTα在淋巴样组织形成中发挥重要作用， 其机制之一是诱导CXCL13、 CXCL19和CCL21的产生。类风湿性关节炎患者滑膜GC的形成是依赖于局部CXCL13和LT的浓度。通常CXCL13由淋巴样组织中FDC所产生。类风湿性关节炎局部浸润炎症细胞产生的TNFα诱导血管内皮细胞和滑膜细胞产生CXCL13， 募集循环中的B细胞和Tfh细胞到达炎症部位， 并诱导LT的表达和异位GC的形成［37］。Sjgren’s综合征患者血清IL21水平明显增加［38］。

　　4.2 Tfh细胞和免疫缺陷 与Tfh细胞功能相关的某些分子如CXCR5、 CD40/CD40L或ICOS/ICOSL等基因缺陷小鼠均可发生体液免疫缺陷。在人类和小鼠当缺乏功能性CD40L、 ICOS或CD28时， CXCR5+CD4+T细胞发生缺陷。X性联淋巴增殖性疾病（Xlinked lymphoproliferative disease， XLP）患者CD4+T细胞在体内外均丧失上调ICOS的能力， 同时伴有辅助B细胞的细胞因子如IL4和IL10产生的缺陷。

　　4.3 Tfh细胞和淋巴瘤 恶性血管免疫母细胞性T淋巴瘤（angioimmunoblastic T lymphoma， AITL）的表型与Tfh具有许多相似性， 例如表达CD4、 Bcl6、 CXCR5、 CD40L和PD1， 并产生CXCL13。但CD10是AITL很独特的标记［39］。AITL患者表现为B细胞活化， 高丙球蛋白血症。在淋巴结中有增生的B细胞滤泡， FDC增殖明显， 恶性T细胞与B细胞和FDC密切接触。推测恶性Tfh细胞产生大量CXCL13和组成性表达CD40L， 持续产生IL21， 不仅促进募集B细胞到淋巴滤泡， 而且使B细胞发生过度活化和产生大量免疫球蛋白。

　　5 结语
　　
　　Tfh依据其表达CXCR5和Bcl6转录因子， 迁移并定位于淋巴滤泡， 通过产生IL21等细胞因子以及表达ICOS等黏附分子辅助B细胞体液免疫功能等特征， 可确定为不同于Th1和Th3的一个新的CD4+效应T细胞亚群。Tfh所产生的IL21除了作为刺激B细胞的“辅助细胞因子”外， 还是Tfh自分泌细胞因子。Tfh ICOS和IL21表达异常参与了自身免疫病和免疫缺陷的发病机制， 并可能成为治疗某些自身免疫性疾病的靶分子。
　　
　　有关Tfh细胞仍有许多重要问题有待进一步深入研究: 如证实Bcl6是决定Tfh分化的转录因子; Tfh与Th17的关系有待进一步阐明; IL21生物学作用是否是一种经典的辅助性细胞因子， 从而对多种类型淋巴细胞产生辅助作用， 而不只对B细胞产生辅助作用; 如何通过有效抑制Tfh的效应分子来治疗人类自身免疫疾病［7］。

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