共表达sCD40LIg和CTLA4Ig双基因修饰原代人内皮细胞包被大鼠胰岛模型的建立

　　　　 作者：李钊伦， 薛武军， 田普训， 刘华， 冯新顺， 丁小明

【摘要】 　　目的: 建立以分离培养的原代人脐静脉内皮细胞包被大鼠胰岛细胞模型。方法: 分离培养原代人脐静脉内皮细胞， 并分别通过免疫组化试验检测人Ⅷ因子相关抗原， 透射电镜观察Weiblepalade小体， 荧光显微镜观察DiIAcLDL的吞噬效果， 对所分离的人脐静脉内皮细胞进行鉴定。分离大鼠胰岛细胞， 然后在肝素化培养皿中进行共表达sCD40LIg和CTLA4Ig双基因的内皮细胞包被。对包被后的胰岛细胞进行形态学观察并检测其包被前后的功能。结果: 分离培养的内皮细胞表达人Ⅷ因子相关抗原， 电镜下可以观察到Weiblepalade小体， 荧光显微镜下可以观察到内皮细胞对DiIAcLDL的吞噬。共表达sCD40LIg和CTLA4Ig双基因的内皮细胞包被胰岛模型可以观察到内皮细胞的绿色荧光， 未包被胰岛和内皮细胞包被胰岛的胰岛素释放指数分别为4.09和3.94， 与未包被胰岛实验组相比， 内皮细胞包被胰岛对高糖刺激反应无明显差异， 但胰岛素释放量有所减少。结论: 成功分离培养并鉴定了原代人脐静脉内皮细胞， 并成功建立内皮细胞包被胰岛细胞模型， 包被后胰岛功能正常。

　　AIM: To isolate and culture primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and then to coat rat islets in vitro. METHODS: Primary HUVECs were isolated and cultured， then they were identified by detecting human Ⅷ factor associated antigen with immunohistochemical method. Weiblepalade bodies were observed by transmission electron microscope and the phagocytosis for DiIAcLDL was detected by fluorescent microscopy. Rat islets were isolated and coated with HUVECs coexpressing sCD40LIg and CTLA4Ig in a heparinized culture dish. The coated islets were observed via morphology and high glucose challenge test. RESULTS: The human Ⅷ factor associated antigen， Weiblepalade bodies and the phagocytosis for DiIAcLDL were found in HUVECs. The islets coated by HUVECs coexpressing sCD40LIg and CTLA4Ig were identified by green fluorescence proteins. Compared with that of the untreated islets (4.09)， the release index of the coated islets was 3.94. There was no difference in insulin release between coated islets and untreated islets under glucose challenge. CONCLUSION: HUVECs have been isolated， cultured and identified successfully. The rat islets were coated with HUVECs in vitro function well.

【关键词】 胰岛; 内皮细胞; 包被; CD40L; CTLA4Ig

　　目前， 胰腺移植或胰岛移植是治疗糖尿病最令人感兴趣的方法之一。在健康胰腺中， 为了解决低氧问题， 胰腺最大限度地促使胰岛和循环血液接触， 以利于胰岛细胞保持更好活力［1］。可是瑞典一个研究小组［2］的研究表明: 在移植早期人胰岛和受者血液接触后会触发即刻性血液介导的炎症反应（instant bloodmediated inflammatory reaction， IBMIR）， 特点是血小板活化并迅速结合到胰岛表面、 凝血和补体系统激活、 粒细胞浸润、 胰岛周围凝血团块形成， 造成移植胰岛死亡。避免IBMIR一个可供选择的办法是在胰岛表面建立起具有生物活性的表面， 阻止胰岛细胞与血液直接接触， 同时又不防碍胰岛细胞摄取营养成分和分泌胰岛素的正常功能。基于此， 我们拟选择可以和血液直接接触的血管内皮细胞进行胰岛细胞包被， 为进一步的临床前期实验提供参考。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 兔抗人Ⅷ因子相关抗原和Biotin标记羊抗兔IgG抗体购自DAKO公司; 胶原酶Ⅱ和明胶购自Sigma公司; 胶原酶P购自Roch公司; RPMI1640培养基、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)和无酚红M199培养基购自Gibco公司; DiIAcLDL购自BTI公司; 血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor， VEGF)购自Chemicon公司; 胰岛素放免试剂盒购自中国原子能科学研究院; DAB试剂盒购自博士德公司; 其余常规试剂为西安交通大学器官移植研究所保存提供。 成年雄性SD大鼠 (8～10周龄， 200～250 g) 购自西安交通大学医学院动物中心。人新鲜脐带来源于西安交通大学医学院第一附属医院(均获得到病患者同意)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原代人脐静脉内皮细胞分离与培养 加10 mL/L明胶溶液1 mL于6孔培养皿内， 37℃孵育1 h 吸去明胶， 无酚红M199培养液冲洗培养皿2次， 加入约2 mL培养液放于37℃孵箱备用。取温PBS液注入人脐静脉血管中洗去残血。血管钳夹紧血管一端， 从另一端向脐静脉血管中注入终浓度为1 mL/L胶原酶Ⅱ， 注入口用丝线结扎保持10 min。吸出含有内皮细胞的消化液， 1 000 r/min离心10 min去上清， 加入含100 mL/L FBS无酚红M199培养液制成细胞悬液， 台盼兰染色观察细胞存活率， 按108～109/L接种入培养器皿中， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养。24 h后第1次换液， 除去未贴壁的细胞， 以后每2 d换液1 次。

　　1.2.2 原代人脐静脉内皮细胞鉴定 (1)细胞免疫组化检测人Ⅷ因子相关抗原: 取6孔培养皿， 每孔内放入2.2 cm×2.2 cm经泡酸处理并灭菌的盖玻片， 以108/L接种细胞; 24 h后弃培养液， PBS液冲洗3次， 预冷40 g/L多聚甲醛固定20 min， 弃去多聚甲醛后PBS洗3次， 加30 mL/L h3O2 20 μL/孔充分覆盖细胞10 min后弃去; PBS轻轻淋洗2 min， 50 mL/L山羊血清500 μL/孔， 置37℃封闭30 min后弃封闭液; 分别加一抗（1∶100）和对照一抗50 μL/孔， 4℃过夜， 弃一抗， PBST轻淋洗1次后， 100 mL PBST漂洗3～5 min， 重复3次; 加1∶100的Biotin标记羊抗兔IgG抗体50 μL/孔， 37℃孵育30 min， PBST洗3次， 每次3～5 min; DAB呈色， 自来水适时终止呈色反应; 梯度酒精脱水， 二甲苯透明， 中性树脂封片， 显微镜观察并照相。 (2)透射电镜观察Weiblepalade (WP)小体: 取培养第2代内皮细胞106～107， 2 000 r/min离心10 min后以25 g/L戊二醛固定液固定， 常规透射电镜样品制备， 切片染色后透射电镜观察并照像。(3)激光共聚焦显微镜观察内皮细胞对LDL的摄取能力: 2.2 cm×2.2 cm 经泡酸处理并灭菌的盖玻片置6孔培养皿中， 以108/L接种细胞， 24 h 后加入6 μL/孔DiIAcLDL (浓度为1 g/L)， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养孵育4 h。将玻片取出放于载玻片上， PBS 液冲洗3次， 甘油封片后上机观察并照像。

　　1.2.3 原代脐静脉内皮细胞包被胰岛模型的建立 (1)大鼠胰岛的分离纯化与鉴定: 100 mL/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉SD大鼠。固定消毒后， 打开腹腔， 丝线结扎胰管紧靠肠壁处， 破心处死大鼠， 胆总管近肝端穿刺、 结扎， 注入4℃ 0.5 g/L胶原酶P溶液8 mL后迅速摘取胰腺， 移入消化瓶于38℃水浴中静止消化20 min后， 振荡使其呈细砂状， 用30目不锈钢网过滤， 加入4℃含100 mL/L新生牛血清Hanks液30 mL终止消化， 1 000 r/mim 4℃离心3 min后进行梯度离心: 沉淀物加入4 mL 250 g/L Ficoll混匀， 依次分别加入230 g/L、 200 g/L、 110 g/L Ficoll溶液和Hanks液各2 mL， 3 000 r/min在4℃离心20 min， 吸取230 g/L和200 g/L界面的胰岛。胰岛DTZ染色鉴定， 把不同直径的胰岛换算为国际胰岛当量(international islet equivalents， IEQ)备用。(2)内皮细胞预处理: 在进行包被实验前3 d， 以感染强度为50（MOI＝50）的AdCD40LIgIRES2CTLA4Ig腺病毒感染内皮细胞， 并在荧光显微镜下观察GFP的表达情况。(3)建立内皮细胞包被胰岛模型: 取无菌6孔培养皿， 每孔加入终浓度为10 U/mL肝素， 37℃静置2 h， 以Hanks液洗涤2次备用。于预处理过6孔培养皿每孔中接种100 IEQ胰岛和1×105腺病毒感染双基因修饰的内皮细胞， 以无酚红M199培养液（含100 mL/L FBS和5 μg/L VEGF）培养2～7 d检测。

　　1.2.4 原代脐静脉内皮细胞包被胰岛模型的鉴定 (1)形态学鉴定: 可见光倒置显微镜下观察胰岛生长情况， 荧光显微镜下目测内皮细胞包被胰岛的面积。(2)包被后胰岛功能鉴定: 包被胰岛经Hanks液洗涤3次， 以自行设计的持续灌注装置检测高糖和低糖刺激下胰岛素分泌量。每5 min收集培养液1次， 连续收集共90 min。第20分钟注入高糖无血清RPMI1640培养液（含16.7 mmol/L葡萄糖、 10 mmol/L茶碱）， 第70分钟注入低糖无血清RPMI1640培养液（含1.67 mmol/L葡萄糖）。实验以培养时间相同的未包被胰岛为对照， 每组实验重复3次， 实验全程处于37℃， 放射免疫法检测收集培养液中胰岛素含量。胰岛素释放指数（Release Index， RI）=高糖胰岛素值/低糖胰岛素值。

　　1.2.5 统计学分析 数据以x±s表示， 使用SPSS10.0软件分析处理， 采用配对t检验比较各组间均数， P&<0.05为有统计学意义， 采用单因素方差分析比较组内均数差异。

　　2 结果

　　2.1 原代脐静脉内皮细胞鉴定结果 免疫组化可以检测到Ⅷ因子相关抗原在胞质的表达， 而且内皮细胞具有相互融合的特点(图1A)。激光共聚焦显微镜发现内皮细胞可吞噬被DiIAcLDL(图1B)。透射电镜观察: 细胞呈多角形， 其表面有许多细小的微绒毛， 细胞核形态不规则， 核内异染色质多沿核膜分布， 核仁可见。细胞质内有少量的胞质空泡， 细胞器丰富， 线粒体、 粗面内质网、 高尔基复合体及核糖体多见， 可见到血管内皮细胞的标志Weiblepalade(WP)小体， 该小体有膜包绕(图1C箭头所示)， 这些都符合内皮细胞的特点。

　　2.2 EC包被胰岛模型的鉴定

　　2.2.1 形态学观察 内皮细胞和胰岛细胞孵育后2 h， 内皮细胞开始以胰岛为基质展开生长， 经2～7 d培养， 内皮细胞可以包被胰岛约50%～80%范围。在荧光显微镜下可以观察到表达双基因CD40LIg和CTLA4Ig的腺病毒所携带的绿色荧光蛋白表达， 这表明内皮细胞包被胰岛成功（图2）。

　　图1 原代人脐静脉内皮细胞鉴定（略）

　　Fig 1 Identification of primary HUVECs

　　A: Detection of the human Ⅷ factor associated antigen using immunohistochemical method(×400); B: Observation of the phagocytosis for DiIAcLDL(×200); C: Observation of Weiblepalade bodies with transmission electron microscope(×15 000).

　　图2 内皮细胞包被胰岛模型（略）

　　Fig 2 HUVECs coated islets(×100)

　　A: Observed by inverted microscope; B: Observed by fluorescence microscope.

　　2.2.2 胰岛葡萄糖灌流试验结果 与未包被胰岛实验组相比， 内皮细胞包被胰岛实验组的胰岛素释放量有统计学意义(P&<0.05)。每组高糖刺激胰岛素分泌量均显著高于低糖刺激， 差异有统计学意义(P&<0.05， 图3)， 未包被胰岛和内皮细胞包被胰岛的刺激指数分别为4.09和3.94(P&<0.05)。这表明内皮细胞包被胰岛的胰岛素释放量总体而言较未包被胰岛降低， 但二者对糖刺激的反应能力相当， 即胰岛素释放功能未受到明显的影响。

　　图3 胰岛功能检测（略）

　　Fig 3 Islet function was tested in a perfusion system

　　3 讨论
　　
　　胰岛移植作为一种潜在的可治愈糖尿病的治疗方法， 一直是糖尿病研究领域的热点， 近年来更取得了突破性进展。2000年加拿大一研究小组提出Edmonton方案， 主要采用了无类固醇激素的sirolimus 和低剂量tacrolimus为基础的免疫抑制方案， 同时加大了胰岛的植入当量［3］。Edmonton方案虽然历史性地促进了胰岛移植成功， 可是在该方案中每个受体至少需要2个或更多的供胰提供胰岛［4］， 这提示有大部分移植胰岛在术后丢失， 可能原因除胰岛处于低氧环境并发生凋亡外， 尤为重要的原因还有: (1)触发即刻性血液介导的炎症反应（IBMIR）。IBMIR会导致胰岛移植物减少， IBMIR现象同时也解释了为什么经门静脉途径行胰岛移植易并发静脉栓塞。(2)发生排斥反应。免疫排斥仍是困扰胰岛移植临床广泛开展的重要问题。发生免疫排斥的机制很多， 其中抗原特异性T细胞介导的细胞毒作用是主要机制之一。
　　
　　血管内皮细胞是可以和血液直接接触的最佳候选细胞。血管内皮细胞为了防止血管内血液凝固， 直接或间接地表达了很多蛋白， 如: 硫酸乙酰肝素、 前列环素、 NO、 血小板来源的ADP和血栓调节素等［5］。此外， 内皮细胞还高表达补体激活调节因子如: 衰变加速因子（MCP， decayaccelerating factor）和CD59 ［6］。所有的这些调节系统在分离得到的胰岛中很少或没有表达， 这也是移植胰岛和血液接触后会激发IBMIR的原因之一。为了解决前面提出的问题， 在本研究中， 我们成功地用原代HUVECs对胰岛进行包被， 从而在胰岛表面建立起具有生物活性的表面。通过检测包被前后胰岛的功能， 证实包被本身不会对胰岛造成明显的损害， 但可能对胰岛素的释放量有一定影响， 这可能归于内皮细胞对β细胞释放胰岛素的物理阻隔作用。Johansson等［5］用人动脉内皮细胞(HAEC)包被胰岛并进行胰岛移植实验， 在成功避免IBMIR的同时延长了移植胰岛存活。但在他们的研究中， 没有考虑到内皮细胞有一定的免疫原性， 如果内皮细胞被活化将会造成不良的后果。基于我们以前的实验结果［7， 8］， 进行胰岛包被前先用共表达分泌型CD40LIg和CTLA4Ig的腺病毒转染内皮细胞， 可以阻断协同刺激信号CD40/CD40L和B7/CD28， 减轻可能的排斥反应。并且阻断CD40/CD40L通路有助于阻止内皮细胞活化。因为该腺病毒同时还表达了GFP， 故还有利于我们在实验中对包被情况予以随时观察， 而无需借助通常的免疫荧光化学方法。
　　
　　在本实验中， 我们首先成功地分离培养并鉴定了原代HUVECs， 还成功地以经CD40LIg和CTLA4Ig双基因修饰的原代HUVECs对胰岛进行了包被实验， 并检测证实包被前后胰岛的功能未受明显的损害。该胰岛包被技术有助于对减轻IBMIR进行深入的研究， 为临床前期研究奠定了基础。

参考文献

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　　［8］ Li ZL， Tian PX， Xue WJ. Coexpression of sCD40LIg and CTLA4Ig mediated by adenovirus prolonged mouse skin allograft survival［J］. J Zhejiang Univ Sci B， 2006， 7(6): 436-444.