siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用

　　　　 作者：石学香， 高美华*， 李先平， 张蓓， 王秋波

【摘要】 　　目的: 构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系， 观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化， 探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法: 应用siRNA表达载体介导的RNAi技术， 构建含特异性CD59基因的重组载体， 脂质体法转染A2780细胞， G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆， RTPCR和Western blot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果， 染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果: 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序， 结果表明序列正确; 重组载体转染A2780细胞， 可表达绿色荧光蛋白， 经G418筛选， 得到抗性细胞克隆， RTPCR和Western blot表明， 稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低， 染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论: 特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功， CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用降低， 为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。

【关键词】 shRNA; CD59; A2780; 补体

　　［Abstract］ AIM: To construct recombinant vectors expressing siRNA that target CD59 gene and a stableinhibit cell line A2780 in order to analyze the role of CD59 in the protection to complementmediated cytolysis. METHODS: The 60 bp encoded targeting CD59 gene shRNA sequence was cloned into pSUPER vector with DNA recombinant technique. The ovary cancer cell A2780 was transfected with this recombinant plasmid using liposome and the stable strains was selected by using G418medium， CD59 mRNA and protein level was detected by RTPCR and Western blot， and its function was analysed by dye release assay. RESULTS: The pSUPERsiRNA expressing vector was successfully constructed. And a stable cell line A2780 was selected and was detected the expression of GFP. The siRNA vector effectively inhibited the CD59 gene expression from mRNA and protein level. Dye release assay suggested that CD59’s protection to complementmediated cytolysis decreased. CONCLUSION: The siRNA vector targeting CD59 gene could consistently inhibit CD59 expression. Furthermore， it decreased CD59’s protection against complement. These results may pave the way for studying the role of CD59 in the immune escape of tumors cells as well as in tumor therapy．

　　［Keywords］shRNA; CD59; A2780; complement

　　［摘 要］ 目的: 构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系， 观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化， 探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法: 应用siRNA表达载体介导的RNAi技术， 构建含特异性CD59基因的重组载体， 脂质体法转染A2780细胞， G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆， RTPCR和Western blot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果， 染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果: 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序， 结果表明序列正确; 重组载体转染A2780细胞， 可表达绿色荧光蛋白， 经G418筛选， 得到抗性细胞克隆， RTPCR和Western blot表明， 稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低， 染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论: 特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功， CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用降低， 为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。

　　［关键词］shRNA; CD59; A2780; 补体

　　CD59是补体终末段的一种调节蛋白， 具有抑制补体攻膜复合物的形成， 保护细胞免遭补体介导的溶细胞作用。近年来， 国外报道已在肠道、 卵巢、 前列腺癌等多种实体肿瘤细胞发现有CD59的高表达［1， 2］。肿瘤细胞高表达CD59， 抑制补体的杀伤作用， 使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体（mAb）治疗中由补体介导的溶细胞作用， 免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因［3， 4］。目前， 在实体肿瘤的免疫治疗中， 一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达［5］。本研究中选择CD59作为靶基因， 应用RNA干扰（RNAi）技术， 构建携带针对CD59的pSUPER retro neogfpCD59重组载体， 以特异性沉默卵巢癌细胞中CD59基因表达， 观察小发夹RNA（shRNA）对靶基因表达的抑制作用， 以及靶基因沉默对CD59抑制补体功能的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人类卵巢癌细胞系A2780、 大肠杆菌JM109及兔抗A2780细胞多克隆抗体由本室保存、 自制， pSUPER retro neo+gfp质粒由青岛大学医学院罗兵教授惠赠， 限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶购自Fermentas公司， E.Z.N.A.Gel Extraction kit购自美国OMEGA公司， Lipofectamne2000和总RNA提取试剂盒来自Invitrogen公司， Access RTPCR A1250试剂盒来自Promega公司， RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司， 小鼠抗人CD59抗体(BD Pharmingen)， 辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司， Rabbit antiβactin购自北京博奥森公司， BCECF购自Sigma公司， 靶向CD59的60 bp oligos由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组载体的构建 应用siRNA设计软件及参照pSUPER载体说明书， 60 nt的寡核苷酸链两端为保护碱基以及Hind Ⅲ和BglⅡ酶切黏性末端， 便于和载体连接。5′端19 nt的序列与靶基因同源， 另一19 nt的序列与其反向互补， 其间有9 nt的环状序列。此寡核苷酸链经退火形成双链DNA后和pSUPER载体连接。本课题组先前针对CD59 mRNA序列设计构建了3条序列发现其中一条能有效抑制CD59的基因的表达（结果另文发表）。本研究中选用这条有效序列（位于CD59 mRNA上318 bp～336 bp）， 以高表达CD59的卵巢癌细胞系A2780作为靶细胞， 研究其干扰效果。其序列如下: 每条链的划线部分序列即为19 nt的靶序列。5′GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3′; As 5′AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3′。

　　1.2.2 重组载体的鉴定 分为PCR鉴定、 酶切鉴定及最终测序。前者初步验证重组载体的正确性， 设计一对引物， 扩增产物为包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为395 bp的核苷酸， 引物序列如下: pSUPERa: 5′CCTTTATCCAGCCCTCACTC3′， pSUPERs: 5′AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3′。阳性克隆可观察到395 bp条带， 而空质粒可观察到1 318 bp条带。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒以及空质粒， 阳性克隆可观察到281 bp条带， 而空质粒可观察到1 204 bp 条带。双阳性质粒送上海生物工程有限公司测序。

　　1.2.3 稳定转染卵巢癌细胞系A2780 A2780用RPMI1640培养液常规培养。当细胞汇合度达80%～90%时， 按说明书利用脂质体Lipofectine 2000（Invitrogen）将重组质粒(T组)及空质粒（T0组）导入细胞， 24 h后， 胰蛋白酶消化细胞， 以1∶10传代培养， 24 h后换含G418（400 mg/L）的选择性培养基。3～4 d后换液， 8～10 d后对照细胞（未转染细胞）全部死亡， G418降半， 3周形成带抗性的单细胞克隆， 挑出扩大培养。倒置荧光显微镜下观察成功转染的细胞均出现绿色荧光， 换用不含G418培养基培养。

　　1.2.4 RTPCR检测目的基因mRNA的表达 TRIzol试剂盒提取细胞总RNA， 采用Promega公司Access RTPCR(A1250)系统进行一步法检测CD59的mRNA表达。以GAPDH为内参照， 引物序列如下: CD59上游引物5′ACAACTGTCCTAACCCAA3′， 下游引物5′GAGTCACCAGCAGAAGAA3′; GAPDH上游引物5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′， 下游引物5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′。扩增片段为267 bp和509 bp。RTPCR反应参数: 48℃孵育45 min， 94℃预变性2 min， 94℃变性30 s， 47℃退火1 min， 68℃延伸2 min， 40个循环后， 68℃延伸7 min。每一RTPCR反应均重复3次。取2 μL RTPCR产物上样， 凝胶呈像系统照相。

　　1.2.5 Western blot检测目的基因蛋白的表达 冰上操作， 刮取细胞， 预冷的PBS（pH7.4）洗涤2次。新鲜配置裂解液(50 mmol/L Tris pH7.5， 150 mmol/L NaCl， 10 g/L Nonidet40， 5 g/L脱氧胆酸钠（避光）， 1 mmol/L EDTA， 2 g/L PMSF， 1 mg/L Aprotinin）。裂解A2780细胞， 收获蛋白， 测定蛋白浓度。用120 g/L的分离胶和50 g/L的浓缩胶SDSPAGE电泳分离蛋白， 转印到PVDF膜上， 分别用CD59的一抗（1∶400）、 辣根过氧化酶标记的二抗（1∶5 000）及βactin的一抗（1∶200）、 二抗（1∶5 000）孵育， DAB显色， 分析条带情况。

　　1.2.6 荧光染料释放试验检测CD59基因干扰后功能的改变 各组A2780细胞均接种2×104/孔100 μL于96 孔培养板培养， 培养基为完全RPMI1640， CO2孵箱培养48 h以上， 洗涤; 每孔加BCECF工作液100 μL， 37℃反应30 min， 洗涤; 每孔加入56℃ 30 min灭活的1∶100稀释的抗A2780细胞抗体50 μL， 37℃反应30 min， 洗涤; 冰上配制25 mL/L、 50 mL/L不同浓度的补体; 每孔加入补体100 μL， 37℃反应20 min; 取上清液， 激发波长503 nm， 发射波长528 nm荧光分光光度仪测定细胞BCECF释放值A1; 每孔加入细胞裂解液50 μL， 冰上裂解30 min， 刮下细胞碎片， 同样条件下荧光分光光度仪测定细胞内BCECF的释放值A2; 计算BCECF的染料释放率。染料释放率=A1/(A1+ A2)×100%。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒的鉴定 空载体全长8 371 bp， 用限制性内切酶BglⅡ/Hind Ⅲ(2 424/1 441位点)切下983 bp的片段。PCR反应产物电泳结果显示， 重组质粒可观察到395 bp的条带， 而空质粒可观察到1 318 bp（983+395）的条带。用EcoRⅠ(2 645 位点）和HindⅢ双酶切重组质粒及空质粒， 结果显示， 空质粒和重组质粒均观察到7 167 bp的 DNA条带， 但空质粒酶切产生的较小的DNA片段为1 204 bp（2 645-1 441）， 而重组质粒pSUPERsiCD59则为281 bp(1 204-983+60)。测序结果显示连入序列正确（图1）。

　　图1 重组质粒PCR反应产物及EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定电泳图（略）

　　Fig 1 Identification of PCR and enzyme digestion of recombinant plasmids

　　A: PCR Identification of recombinant plasmids. M: DL 2 000 DNA marker; 1: pSUPERsiCD59; 2: pSUPER. B: Identification of enzyme digestion of recombinant plasmids. M: DL 2 000 DNA marker; 1-5， 7: pSUPERsiCD59; 6; pSUPER.

　　2.2 siRNA抑制A2780细胞中绿色荧光蛋白的表达 重组质粒pSUPERsiCD59及空质粒经脂质体法转染A2780细胞获得单细胞克隆扩大培养后， 倒置荧光显微镜下观察到有绿色荧光出现（图2）。

　　图2 转染后GFP在A2780细胞上的表达（略）

　　Fig 2 Expression of GFP on A2780 cells after transfection (×200)

　　A: GFP expression in A2780 cells after transfection(T0 group); B: GFP expression in A2780 cells after transfection(T group).

　　2.3 RTPCR和Western blot检测靶基因CD59 mRNA和蛋白水平的变化 RTPCR结果显示CD59基因在实验组T组mRNA的水平较对照组T0组降低， 而内参GAPDH的扩增一致。Western blot 显示T组CD59蛋白的表达低于T0组， 内参βactin的表达基本一致。实验结果表明A2780细胞中CD59的表达得到了稳定抑制（图3）。

　　图3 RTPCR和Western blot 显示稳定抑制A2780细胞后CD59的表达（略）

　　Fig 3 CD59 mRNA and protein level was detected in stable transfected A2780 cells by RTPCR and Western blot

　　A: CD59 mRNA expression by RTPCR; B: CD59 protein expression by Western blot.

　　2.4 染料释放试验结果 采用正常人新鲜血清作为补体的来源， 用含10 g/L的BSA的HBSS冰上配置25 mL/L、 50 mL/L不同浓度的补体。T组和T0组每个补体浓度各设6个复孔， 测定CD59功能的改变。统计检验采用两个样本率差别的统计意义检验。结果表明， 在同一补体稀释度下， T组染料释放率明显高于对照组（P&<0.01， 图4）， 说明CD59基因受抑制后， 对补体溶破的抵抗作用降低。

　　3 讨论
　　
　　RNAi是自然界中普遍存在的一种重要的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）现象， 能产生对相应序列mRNA的特异性降解。鉴于CD59基因的过度表达是肿瘤免疫逃逸导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因， 故可作为选择性干预的靶基因。RNAi根据具体工具不同可进一步划分为5种实验方法， 即化学合成法、 体外转录法、 制备siRNA混合物、 siRNA表达盒子（SECs）和siRNA表达载体法。siRNA表达载体法的特点在于质粒可以在细胞内复制扩增， 这种带有抗生素抗性标记的载体抑制基因， 表达的效果可持续几周甚至更长， 这使之成为适用于较长周期研究的方法［6， 7］。

　　图4 稳定抑制CD59基因后A2780细胞的染料释放率变化（略）

　　Fig 4 Change of dye release rate in stable transfected A2780 cells

　　本研究构建了pSUPERsiCD59转录载体。携带靶序列的载体带有绿色荧光蛋白编码基因和新霉素抗性基因， 可用于判断转染效率和筛选稳定克隆， 带有依赖RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子可转录生成针对靶基因的shRNA， 在体内再加工生成双链的小干涉RNA， 进而降解相应的靶mRNA。本研究用G418筛选的稳定克隆在荧光倒置显微镜下观察50%～60%左右的细胞可观察到绿色荧光蛋白的表达， 说明转染效率较高。RTPCR和Western blot发现干扰组靶基因CD59的表达量显著降低， 说明pSUPERsiCD59载体能有效发挥拆除CD59基因的作用。染料(BCECF)释放试验可用于CD59活性的测定［8］。功能性CD59可抑制MAC形成， 保护细胞免受损伤。染料释放率与CD59抗补体活性呈负相关。检测结果表明， 干扰组染料释放率升高， 说明CD59分子抗补体活性下降， 表明CD59失去抑制MAC形成功能。
　　
　　研究显示CD59在卵巢癌上高表达［9］。本研究构建的pSUPERsiCD59载体能有效抑制卵巢癌细胞系A2780上CD59的表达并使其抗补体活性下降， 避免了肿瘤细胞逃脱自身的免疫监视， 有利于机体肿瘤的清除。CD59siRNA载体的构建成功为更深入地探讨CD59基因沉默对CD59阳性肿瘤细胞凋亡和增殖分化的影响， 进行CD59相关肿瘤的免疫治疗奠定了实验基础。

参考文献

　　［1］ Fonsatti E， Altomonte M， Coral S. Emerging role of protectin (CD59) in tumor immunotherapy of solid malignancies［J］. Clin Ter， 2000， 151(3): 187-193.

　　［2］ Fisheison Z， Donin N， Zell S， et al. Obstacles to cancer immunotherapy: expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumors［J］. Mol Immunol， 2003， 40(2/4): 109-123.

　　［3］ Den C， Fonsatti E， Sigalotti L， et al. Recombinant transmembrane CD59 (CD59TM) confers complement resistance to GPIanchored protein defective melanoma cells［J］. J Cell Physiol， 2002， 190(2): 200-206.

　　［4］ Gorter A， Meri S. Immune evasion of tumor cell using membranebound complement regulatory proteins［J］. Immunol Today， 1999， 20(12): 576-582.

　　［5］ Huang Y， Smith CA， Song H， et al. Insights into the human CD59 complement binding interface toward engineering new therapeutics［J］. J Biol Chem， 2005， 280(40): 34073-34079.

　　［6］ Brummelkamp TR， Bernards R， Aami R， et al. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］. Science， 2002， 296（5567）: 550-553.

　　［7］ Sui G， Soohoo C， Affarel B， et al. A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（8）: 5515-5520.

　　［8］ Cheng Ying， Gao Meihua. The effect of glycation of CD59 on Complentmediated Cytolysis［J］. CMI， 2005， 2(4): 313-317.

　　［9］ Bjorge L， Stoiber H， Dierich MP， et al. Minimal residual disease in ovarian cancer as a target for complementmediated mAb immunotherapy［J］. Scand J Immunol， 2006， 63(5): 355-364.