体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立

　　　　作者：李贺， 向泽敏， 吴秀丽， 王莉， 卫红飞， 万敏， 王丽颖， 于永利

【摘要】 　　目的: 建立体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法: 利用分子克隆技术构建真核表达载体pcDNA3GFPHER2， 阳离子脂质体介导法将其稳定转染入B16细胞， G418克隆筛选及体内传代后， 流式细胞术(FCM)分选出GFPHER2表达阳性细胞群， 对该群细胞进行无G418条件下的单克隆筛选并进行体内稳定性检测。结果: 经限制性内切酶鉴定及序列分析， pcDNA3GFPHER2构建正确; 最终建立的表达HER2基因B16细胞系体内传代后GFPHER2阳性率高于90%。结论: 成功建立了体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系， 为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的建立提供了借鉴。

【关键词】 小鼠黑色素瘤细胞; HER2; 阳离子脂质体

　　［Abstract ］ AIM: To establish a B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo. METHODS: Eukaryotic expressing vector pcDNA3GFPHER2 was constructed by molecular cloning technique and transfected into B16 cells mediated by cationic liposome. After screened with G418， the transfected cells were passaged in vivo. The GFPHER2 positive cells were isolated from tumor burdening mice by flow cytometry (FCM) sorting， and then monoclonized in the absence of G418 to obtain a B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo. This cell line was then identified after being passaged in vivo. RESULTS: Restriction endonulease analysis and DNA sequencing showed that the pcDNA3GFPHER2 was constructed and a B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides in vivo was obtained successfully. The GFPHER2 positive proportion maintained higher than 90% after being passaged in vivo. CONCLUSION: A B16 cell line stably expressing genes encoding HER2 multiepitope peptides is established successfully， which would provide a method to establish other cell lines stably expressing exogenous genes.

　　［Keywords］B16 cell; HER2; cationic liposome

　　基因转染技术是生物学研究的重要手段［1， 2］， 目前用于基因转染的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。阳离子脂质体转染法属于非病毒载体介导的基因转染方法， 由于其具有操作方法简单、 可携带大片段DNA、 试剂商品化和毒性低、 安全和无免疫原性等优点， 而逐渐替代病毒载体并为广大研究者所接受。但阳离子转染法转染的细胞在体内存在稳定性差的缺点［3， 4］， 这也一直是困扰大家的的难题。为了解决阳离子脂质体介导的基因转染细胞的体内稳定性问题， 本研究以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein， GFP）为报告基因， 将阳离子脂质体转染法及小鼠体内细胞传代、 流式细胞术(FCM)分选、 无G418条件下的体外筛选等技术相结合， 建立了小鼠体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系（B16）， 该实验体系的建立为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的制备提供了很有价值的参考。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 健康清洁级C57BL/6J小鼠(雌性， 6～8 周龄)， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lipofectin、 TRIzol试剂购自Invitrogen公司。pMD18THER2载体（含HER2多表位基因)、 pcDNA3GFP载体、 C57BL/6J小鼠来源的黑色素瘤细胞株B16由吉林大学白求恩医学院分子生物学实验室提供。G418、 IMDM干粉购自Gibco公司。标准胎牛血清（FBS）购自天冿TBD公司。限制性内切酶、 T4连接酶和DNA marker购自TaKaRa公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcDNA3GFPHER2载体的构建 应用Hind III和BamH I分别酶切pMD18THER2和pcDNA3GFP载体， 经琼脂糖凝胶回收， 将载体和目的片段进行连接， 连接产物转化E.coli JM109。挑选转化平板上的单菌落接种于5 mL LB培养基， 过夜培养， 以碱裂解法提取质粒。重组质粒经Hind III和BamH I双酶切鉴定并进行测序分析。鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。

　　1.2.2 细胞转染及鉴定 参照说明书应用阳离子脂质体Lipofectin将pcDNA3GFPHER2转染入小鼠黑色素瘤细胞系， 转染后的细胞用含200 mL/L FBS IMDM（IMDM完全培养液）稀释， 按每孔0.2个细胞/100 μL铺96孔平底培养板， 37℃、 5 mL/L CO2孵箱中培养。次日， 每孔补加100 μL含1 600 mg/L G418的IMDM完全培养液， 1 周后用含800 mg/L G418的IMDM完全培养液换液。2 周后在共聚焦荧光显微镜下观察， 选择细胞状态好、 荧光强、 呈单集落生长的细胞进行扩增， 即获得GFPHER2表达阳性的B16细胞。将上述细胞经过液氮冻存、 37℃水浴复苏和连续传代培养2 周后， 用共聚焦荧光显微镜和FCM在蛋白水平上检测GFPHER2的表达。参照TRIzol试剂说明书提取转染细胞的总RNA， 逆转录后进行PCR反应， 检测HER2基因mRNA的表达（上游引物: 5′CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3′; 下游引物: 5′GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA3′）。

　　1.2.3 体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立及鉴定 将3×105个细胞（G418 800 mg/L环境中培养）重悬于0.2 mL IMDM中， 皮下接种于C57BL/6J小鼠右侧后腿躯干处。待肿瘤大小约为1 cm×1 cm时， 进行无菌剖离， 研磨。将细胞悬液置于IMDM完全培养液中， 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。次日， 更换IMDM完全培养液， 继续培养贴壁细胞， 1 周后即得到经体内传代后的pcDNA3GFPHER2转染的B16细胞。应用流式细胞仪（BD FACS Aria Cell Sorter）检测该群细胞中GFPHER2表达情况， 并分选出GFPHER2表达阳性的细胞。
　　
　　将GFPHER2表达阳性的B16细胞用IMDM完全培养液稀释， 按每孔0.2个细胞/200 μL的比例， 铺96孔平底培养板， 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。2 周后应用FCM和共聚焦荧光显微镜观察各细胞克隆的GFP表达情况， 选择细胞状态好、 荧光强、 GFPHER2表达率高、 呈单集落生长的细胞进行扩增， 得到体内稳定表达HER2基因的B16细胞系。将上述方法得到的B16转染细胞进行体内传代（方法同前， 接种前在不含G418环境中培养）， 记录肿瘤发生时间并通过共聚焦荧光显微镜及FCM检测GFPHER2表达情况。

　　2 结果

　　2.1 pcDNA3GFPHER2载体的构建 pcDNA3GFPHER2载体经Hind III及BamH I酶切后， 8 g/L琼脂糖凝胶电泳显示1 054 bp基因片段（图1）; 序列分析结果表明， 质粒pcDNA3内插入片段的碱基顺序完全正确， 表明pcDNA3GFPHER2重组质粒构建成功。

　　2.2 转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞鉴定 阳离子脂质体转染法将pcDNA3GFPHER2重组质粒转染B16细胞， 通过G418压力筛选及有限稀释法进行筛选和克隆化， 得到1株转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞， 命名为B16/HER21。经RTPCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定， 得到344 bp的HER2特异性条带（图2A）。共聚焦荧光显微镜检测发现， 该细胞发出较强的绿色荧光（图2B）; FCM检测结果显示， 转染效率达到73.53%（图2C）， 提示在成功建立了pcDNA3GFPHER2转染B16细胞系， 该细胞在G418存在的情况下比较稳定。

　　图1 pcDNA3GFPHER2重组质粒的鉴定（略）

　　Fig 1 Identification of recombinant pcDNA3GFPHER2 plasmid

　　1: DNA marker; 2: Recombinant pcDNA3GFPHER2 plasmid digested with Hind III and BamH I.

　　图2 转染pcDNA3GFPHER2的B16细胞（B16/HER21）的鉴定（略）

　　Fig 2 Identification of B16 cells transfected with pcDNA3GFPHER2 (B16/HER21)

　　A: RTPCR of HER2 gene. 1: DNA marker; 2: B16/HER21; 3: B 16 cells.B: Confocal microscopy of B16/HER21 (×100).C: FACS analysis of B16/HER21.

　　为了获得体内稳定表达HER2多表位基因的B16细胞系， 我们将B16/HER21接种到小鼠皮下， 检测体内传代后GFPHER2表达的情况， 结果显示， 体内传代后该转染细胞GFPHER2表达率为22.50%（图3A）， 仅为体内传代前的30.56%， 提示该转染细胞在体内稳定性较差。依据GFP的绿色荧光指示， 应用FCM分选出该细胞中GFPHER2表达阳性的细胞， 再在无G418的环境中进行单克隆化， 最终得到1株生长状态好， 绿色荧光强度高的细胞。该细胞GFPHER2表达的阳性率可达94.32％（图3B）， 命名为B16/HER22。为了观察B16/HER22的体内稳定性， 我们再次将该细胞株进行了体内传代， 在肿瘤接种后15 d内出瘤率达到100%（图4A）。对剥离后的肿瘤进行GFPHER2表达情况的鉴定， 阳性细胞率为90.21%（图4B、 C）， 与体内传代前无明显差别。
　　
　　综上， B16细胞在常规的阳性脂质体稳定转染后经G418克隆筛选， 再进行体内传代、 FCM分选以及体外的无G418培养条件下的单克隆筛选， 可以获得体内稳定的HER2多表位基因转染细胞系。

　　图3 B16/HER2细胞GFPHER2的表达率（略）

　　Fig 3 Expression rate of GFPHER2 of B16/HER2

　　A: Expression rate of GFPHER2 of B16/HER21; B: Expression rate of GFPHER2 of B16/HER22.

　　图4 B16/HER22体内稳定性分析（略）

　　Fig 4 Analysis of the stability of B16/HER22 in vivo

　　A: The tumor genesis ability of B16/HER22; B: Confocal microscopy of B16/HER22 (×100); C: FACS analysis of B16/HER22.

　　3 讨论
　　
　　为了实现HER2多表位基因在B16细胞中的高效表达， 本实验中选用了真核表达载体pcDNA3， 其特点为: ①复制能力强， 是保证目的基因稳定表达的因素之一; ②含有促进基因转染活性的顺式调控元件高效增强子SV40， 并具有功能强大的巨细胞病毒启动子和牛生长素加尾信号， 从而能保证目的基因的高效表达; ③带有neo 基因， 可用于筛选稳定表达的转染细胞［5］。 为了便于转染细胞的筛选， 根据GFP无需染色， 对细胞无毒性， 在受到紫外线激发时会发出绿色荧光的特点［6］， 我们将其作为报告基因， 与HER2多表位基因相连接， 构建了真核表达载体pcDNA3GFPHER2。
　　
　　在将外源基因引入细胞的过程中， DNA会被体内的核酸酶降解， 在未进入靶细胞， 甚至未达到靶器官时便降解成小分子核苷酸， 从而失去相应的作用， 因此， 外源基因进入细胞便需要基因载体的参与。基因载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类， 其中病毒载体虽然转染效率高， 但病毒载体存在自身难以克服的局限性， 如能诱导宿主免疫反应及潜在的致癌性， 制备方法复杂， 而且所能装载的外源DNA的大小有限， 使其应用受到很大限制。非病毒载体具有低毒、 低免疫反应， 外源基因整合几率低、 无基因插入片段大小限制， 以及使用简单、 制备方便、 便于保存和检验等优势， 日益被广大科学研究者接受［7， 8］。为此， 本实验选择了非病毒基因载体中较受青睐的一种阳离子脂质体作为转染工具。阳离子脂质体虽然有上述的很多优点， 但它也有致命的缺点， 应用该方法转染的细胞在体内存在不稳定性， 这主要是外源基因并未稳定的整合到宿主细胞染色体基因组中， 不能在宿主细胞传代的过程中稳定遗传。由于体内环境中不存在筛选压力， 无法进行转染细胞的生存选择， 丢失外源基因的细胞形成优势生长， 使得转染细胞在体内稳定性极差。如果某一株转染细胞的外源基因已稳定的整合到宿主细胞的基因组中， 那么细胞传代过程中将不会再出现外源基因的丢失， 找到这样的细胞克隆， 势必能解决转染细胞体内稳定性的问题。因此， 我们尝试将B16细胞进行阳离子脂质体转染和G418压力筛选后， 体内传代、 FCM进行分选， 富集体内不丢失外源基因的转染细胞， 并进一步模拟体内环境在体外进行无G418条件下进行单克隆筛选， 以期建立体内稳定表达外源基因B16细胞系。
　　
　　在本实验中， 经脂质体介导的稳定转染及G418压力筛选所得转染细胞株经体内传代后， 约22.50%的细胞稳定表达GFPHER2， 根据GFPHER2的绿色荧光指示， 通过FCM分选出这群细胞， 再进行单克隆筛选（在体外无G418的环境中培养）， 最终获得了一株外源基因阳性表达率达94.32％的细胞， 该细胞体内传代后外源基因阳性率仍可达90.21%， 达到了预期的实验目的。
　　
　　综上， 本实验将传统的阳离子脂质体稳定转染、 G418压力筛选及体内传代、 FCM分选、 无G418条件下的体外筛选相结合， 成功建立了体内稳定表达HER2基因的B16转染细胞系， 为其他体内稳定表达外源基因转染细胞的建立提供了借鉴方法。

参考文献

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