荷瘤小鼠T细胞表面CD59分子的表达与T细胞信号转导的相关性研究

【关键词】 荷瘤小鼠T细胞　CD59分子　T细胞信号

　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol， GPI)锚着于细胞膜表面的糖蛋白， 广泛分布于造血细胞、 非造血细胞及多种组织细胞表面， 其主要功能是调节补体活化， 通过与补体攻膜复合物（membrane attack complex， MAC）装配过程中的C8 和/或C9 结合从而抑制补体的活化［1］。有许多研究证实， CD59也参与T细胞的黏附及细胞信号的转导［2］。荷瘤机体的T细胞往往出现活化信号转导异常， 导致其功能低下， 甚至处于无反应状态［3］。最近有学者研究发现CD59在肿瘤患者的红细胞上的表达明显降低， 导致天然免疫的失衡［4］。但对于荷瘤机体内T细胞CD59的表达情况及对T细胞活化的影响， 尚未见报道。本研究将通过建立小鼠HeLa细胞肿瘤模型， 对荷瘤机体T细胞的CD59表达情况及对T细胞活化的影响进行探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 HeLa细胞致瘤模型小鼠由本课题组前期建立; 淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司; 纯化的CD59单克隆抗体（mAb）为BD Biosciences的产品; 荧光探针Fluo3/AM购自Biotium， HEPES(Solarbio); FITC标记山羊抗小鼠IgG(HL)为中杉金桥公司产品， FITC标记的抗小鼠CD25和PE标记的抗小鼠CD4均购自Biolegend公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞制备 取前期HeLa细胞致瘤的小鼠和正常对照小鼠， 无菌分离两组小鼠胸腺， 制备单细胞悬液， 淋巴细胞分层液获取单个核细胞， 再经尼龙柱处理获取T淋巴细胞， 苔盼蓝染色细胞活率95%以上。调整细胞密度为4×108/L， 加入100 mL/L胎牛血清， 青霉素、 链霉素各100 mL/L的RPMI1640培养液10 mL， 50 mL/L CO2 、 37℃培养箱培养。

　　1.2.2 T细胞表面CD59表达 取1 mL两组T细胞， PBS洗3遍， 滴于载玻片上吹干， 950 mL/L乙醇固定5 min， 吹干; 加CD59mAb(1∶640)， 10 μL， 对照加IgG2a， 10 μL， 37℃湿盒孵育45 min， PBS洗3遍， 5 min/次， 吹干; 加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(HL)（1∶320）， 10 μL， 37℃湿盒孵育45 min， PBS洗3遍， 5 min/次， 吹干; 荧光显微镜观察。荧光的检测及结果判定: 随机选取5个视野， 根据特异荧光强弱依次用弱阳性（±）、 阳性（+）、 强阳性（）表示， 无特异性荧光的用阴性（-）表示， 并根据荧光强度记分: 阴性为0分， 弱阳性为1分， 阳性为2分， 强阳性为3分。

　　1.2.3 细胞内Ca2+的测定 (1)Fluo3/AM负载细胞: 取前期准备的小鼠淋巴细胞， 经苔盼蓝染色细胞活率95％以上， 调整细胞密度为5×109/L， HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍， 加10 μmol/L Fluo3/AM ， 100 μL， 37℃孵育40 min。孵育后， 1 000 r/min， 离心10 min， 吸弃Fluo3/AM上清， HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍。加0.5 mL HEPES缓冲液， 待检。(2) T细胞内Ca2+的测定: 使用Nikon激光共聚焦显微镜检测细胞内的Ca2+， 按文献方法［5］检测。结果以未加处理因素前的荧光值为100%。

　　1.2.4 流式细胞术检测T淋巴细胞CD25表达 T细胞中加入1 mg/L CD59mAb， 37℃孵育48 h。调整细胞密度2×108/L， 吸取250 μL不同组细胞悬液平均分放1、 2、 3号EP管中， 设置对照组和同型对照组， 加入FITC标记的抗小鼠CD25， PE标记的抗小鼠CD4， 各10 μL， 混匀后， 4℃避光作用30 min， 50 g/L白蛋白PBS洗2次， 5 min/次。多聚甲醛固定， 避光保存， 24 h内流式细胞仪进行分析。

　　1.2.5 统计学分析 所有数据以x±s， 两样本比较采用双样本t检验， 全部统计处理均在SPSS10.0软件上进行。

　　2 结果

　　2.1 T细胞CD59表达 分别观察对照组和实验组T细胞表面CD59特异荧光的表达， 实验组荧光表达明显减弱， 差别有统计学意义（P&<0.05， 表1）。

　　表1 两组T细胞CD59表达的比较（略）

　　2.2 CD59mAb对两组T细胞［Ca2+］i的影响 加入CD59mAb后， 静息T细胞中［Ca2+］i明显升高， 1 min正常对照组即升至(452.7±65)%， 而荷瘤组升至（287.1±56）%， 两者比较差异有统计学意义（P&<0.01， 表2）。

　　2.3 CD59mAb作用下小鼠T细胞CD25的表达 小鼠T淋巴细胞静息状态下很少表达CD25分子， 经CD59mAb刺激48 h后， CD25表达增加。荷瘤组CD25表达比正常组明显减少， 差异有统计学意义（P&<0.05， 图1）。

　　表2 CD59mAb对小鼠T细胞［Ca2+］i的影响（略）

　　bP&<0.01 vs非肿瘤模型.

　　图1 小鼠T细胞CD25的表达（略）

　　3 讨论
　　
　　近年来研究发现， 荷瘤宿主T细胞信号转导缺失， 导致其功能低下甚至处于无反应状态。T细胞表达的CD59具有细胞信号转导的功能， 而有关其在肿瘤机体内的变化及作用机制， 尚未见报道。我们的实验显示， 荷瘤小鼠T细胞CD59的荧光表达较正常对照组减弱， 差别有统计学意义， 初步证实荷瘤小鼠T细胞CD59表达减少。为进一步研究CD59表达减少对T细胞信号转导的影响， 我们用CD59mAb交联CD59， 发现［Ca2+］i明显升高， 且荷瘤组［Ca2+］i升高幅度远低于正常组， 差异显著。Ca2+为胞内第二信使， 其与钙调蛋白（CaM）结合形成Ca2+CaM复合物， 激活其靶酶， 向下游传递信号［6］。［Ca2+］i升高说明CD59经特异抗体交联后产生信号， 并将其传至胞内， 且信号强弱与T细胞表达CD59的量有关。
　　
　　CD25是T细胞中期活化抗原， 静息T细胞表达少， 活化后则大量诱导表达［7］。我们用CD59mAb刺激T淋巴细胞表达CD25， 结果显示， 正常小鼠T细胞CD25表达强于荷瘤小鼠T细胞（P&<0.05）， 可能是荷瘤小鼠T细胞CD59表达减少甚至缺失， 细胞信号转导受抑， 导致T细胞活化减少。
　　
　　综上结果显示， 荷瘤组T细胞CD59表达减少， 导致T细胞信号转导受抑、 活化减弱。CD59在T细胞信号转导中发挥重要作用。

参考文献

　　［1］ Farkas I， Baranyi L， Ishikawa Y， et al. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhibitsion channel formation by homologous C5b8 as well as C5b9［J］. Physiol， 2002， 539(Pt2): 537-545.

　　［2］ Korty PE， Brando C， Shevach EM， et al. CD59 functions as a signal transducing molecule for human T cell activation［J］. Immunol， 1991， 146(2): 4092-4098.

　　［3］ 陈诗书. 医学细胞与分子生物学［M］. 上海: 上海医科大学出版社， 1995: 566.

　　［4］ 郭 峰， 钱宝华， 花美仙， 等. 肿瘤患者红细胞天然免疫分子CD35、 CD59相关性研究［J］. 中国免疫学杂志， 2004， 20(2): 136-137.

　　［5］ 李明春， 雷林生， 梁东升， 等. 灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞浆游离Ca2+浓度的影响［J］. 中国药学杂志， 1999， 34（12）: 805-807.

　　［6］ Fraser JD， Straus D， Weiss A. Signal transduction events leading to T cell lymphokine gene expression［J］. Immunol Today， 1993， 14(7): 357-362.

　　［7］ GonzalezGarcia A， Merida I， Martinez AC， et al. Intermediate affinity interleukin2 receptor mediates survival via a phosphatidy linositol 3Kinasedependent pathway［J］. Biol Chem， 1997， 272(15): 10220-10226.