IGF1R的真核表达和单克隆抗体的制备

　　　　 作者：张翠珍， 余君铭△， 周敏， 刘世国， 高慧萍， 田淑君， 李宗海

【摘要】 　　目的: IGF1R稳定表达株的建立和抗IGF1R单克隆抗体（mAb）的制备。方法: 从cDNA扩增得到人全长IGF1R基因， 构建成含有ETag的质粒。用此质粒建立稳定表达IGF1R的细胞株， 并免疫BALB/c小鼠， 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功构建IGF1R病毒质粒， 并筛选得到稳定表达IGF1R的3T3细胞， 该细胞免疫BALB/c小鼠后筛选得到6株稳定分泌抗IGF1R抗体的杂交瘤细胞株， Western blot结果显示抗体8G3能特异性识别抗原。结论: 成功制备了IGF1R的mAb， 为进一步研究IGF1R在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。

【关键词】 IGF1R; 真核表达; 杂交瘤; 单克隆抗体

　　胰岛素生长因子1受体（insulin growth factor I receptor， IGF1R）及其配体IGF在肿瘤发生和转移中的作用研究是近年来的热点。研究发现， IGF1通过IGF1R的介导， 可以在其他生长因子缺乏的情况下， 促使细胞增殖周期完成［1］， IGF1R在细胞表面的表达量和细胞阻止凋亡的能力成正比［2］。已经有很多研究表明， IGF1R与肿瘤的产生， 发展和转移密切相关［3， 4］。可见阻止IGF1R的生物学功能， 具有很大的临床应用前景。我们用真核表达的IGF1R作为抗原， 制备了特异性单克隆抗体(mAb)， 为研究IGF1R在肿瘤治疗领域的应用提供了有力的工具。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒pWPXL、 PMD2G、 PAX2均由瑞士日内瓦大学T.Didier博士惠赠、 大肠杆菌Top10株， HEK 293T细胞系、 NIH HeLa细胞、 NIH 3T3细胞系以及Sp2/0细胞均由本室保存; 限制性内切酶BamH I、 EcoR I和Nde I均购自大连宝生物公司; 血液采自健康人; 胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG是Sigma公司产品。抗ETag抗体是GE Healthcare产品。BALB/c小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养和传代 HEK 293T、 NIH HeLa和NIH 3T3细胞系培养条件为: 在37℃、 50 mL/L CO2的培养箱中， 用含有100　　mL/L胎牛血清（NIH 3T3用小牛血清）， 100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液培养， 并用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期， 生长状态良好的细胞用于实验。

　　1.2.2 人cDNA的制备 取6 mL稀释血液（PBS等比稀释）， 加入3 mL淋巴细胞分离液， 400 g， 室温离心20 min。取单个核细胞， 加入5倍PBS， 400 g， 室温离心10 min， 重复1次， 去上清， 加入1 mL TRIzol/106细胞， 室温静置5 min， 加200 μL氯仿， 剧烈震荡1 min， 室温静置5 min， 12 000 g， 4℃离心15 min。取上清于另一离心管， 加等体积异丙醇沉淀， -20℃放置10 min， 12 000 g， 4℃离心15 min， 去上清， 加入750 mL/L乙醇500 μL洗1次， 加适量DEPC水溶解， 行RTPCR。反应条件: 70℃ 5 min， 25℃ 5 min， 42℃ 1 h， 70℃ 15 min。

　　1.2.3 引物的设计 从GenBank获得人全长IGF1R基因序列， 并据此设计引物。正向引物P1为: 5′CGGGATCCATGAAGTCTGGCTCCGGAG3′含BamH I酶切位点; 逆向引物P2为: 5′CGGAATTCGCAGGACGAAGACTGGGG3′含EcoR I酶切位点。

　　1.2.4 IGF1R基因的扩增、 克隆及测序 以人cDNA为模板， P1和P2为引物， 扩增目的基因。PCR反应条件: 94℃ 4 min， 然后94℃ 45 s， 57℃ 45 s， 72℃ 4 min， 共30个循环， 再于72℃延伸10 min。回收PCR产物。空载体pWPXL和ETag（序列为ggtgcgccggtgccgtatccggatccgctggaaccgcgt）用EcoR I和Nde I双酶切后连接， 再经双酶切去掉自带的GFP片段形成新载体pWE， 测序确认。用BamH I和EcoR I双酶切PCR产物和pWE， 回收片段， 连接， 转化Top10感受态细胞。长出的克隆抽提质粒， 用BamH I和EcoR I双酶切鉴定， 选取阳性克隆测序。

　　1.2.5 IGF1R稳定表达株的建立 采用人HIV病毒的缺陷株做为慢病毒载体， 携带目的基因， 感染细胞获得稳定表达株。pWEIGFR、 PMD2G、 PAX2质粒用磷酸钙法共转染293T细胞， 包装产生携带目的基因的病毒颗粒。48 h后收慢病毒颗粒， 将收取的病毒颗粒感染NIH3T3细胞。Western blot 鉴定阳性， 然后采取有限稀释法获得单克隆， 得到IGF1R稳定表达株。

　　1.2.6 小鼠免疫 培养稳定表达IGF1R的3T3细胞， 离心后用PBS（pH7.4）重悬， 每只BALB/c小鼠皮下注射5×106细胞， 连续3次， 每次间隔2周， 第4次免疫后7 d， 用ELISA法检测抗血清效价， 取效价最高的小鼠， 脾内注射1×105个细胞加强免疫， 3 d后取小鼠脾脏待用。

　　1.2.7 细胞融合与抗体制备 取脾细胞与骨髓细胞Sp2/0融合［5］。用间接ELISA法［6］筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有效稀释法克隆化后， 选择1株mAb持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前1周， 小鼠腹腔注射500 μL液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞 ， 用不完全培养液悬浮并混匀， 将细胞数调至1×109/L， 每只小鼠腹腔注射500　　 μL， 1周后小鼠腹部明显肿胀， 消毒下腹部皮肤后， 抽取腹水， 所得腹水3 000 r/min， 收集上清。用硫酸铵法初步纯化腹水， 备用。

　　1.2.8 mAb的效价和鉴定 ① 效价测定: 采用间接ELISA法。用3T3细胞种96孔板， 3×104/孔， 并用甲醛固定。 一抗为制备的抗IGF1R的mAb 8G3， 二抗为HRP山羊抗小鼠IgG， 1∶1 000稀释， 经ABTS（2， 2’连氮基双(3乙基苯并二氢噻唑啉6磺酸)二铵盐）底物显色后， 于波长405 nm测定吸光度(A)值。②特异性鉴定: Western blot法分析， 提取HeLa细胞蛋白跑SDSPAGE胶， 电转移至硝酸纤维素（NC）膜上， 用50 g/L牛奶室温封闭2 h， 一抗（1∶500稀释）， 4℃孵育过夜。二抗为HRP山羊抗小鼠IgG， 用50 g/L牛奶1∶1 000稀释， 37℃， 1 h。用发光液孵育5 min， 压片观察结果。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒的鉴定 重组表达质粒pWEIGFR经BamH I和EcoR I双酶切后出现4 113 bp的目的条带， 符合预期大小， 测序结果显示序列正确， 表明重组质粒构建成功。

　　图1 IGF1R的扩增和阳性克隆鉴定（略）

　　1: λ/Hind III DNA marker; 2: IGF1R的PCR产物; 3: 重组质粒pWEIGFR的酶切分析.

　　2.2 IGF1R稳定表达株的鉴定 构建好的pWEIGFR质粒在HEK293T细胞中包装并收集病毒颗粒， 转染3T3细胞， 筛选得到稳定表达IGF1R的细胞株， 并以抗ETag的抗体作为一抗， 用Western blot鉴定， 结果见图2。

　　图2 IGF1R稳定表达株的Western blot鉴定（略）

　　1: pWE转染3T3细胞; 2: pWEIGFR转染3T3细胞.

　　2.3 抗IGF1R蛋白mAb的制备和初步鉴定 血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进行融合后， 筛选到6株阳性克隆， 分别为8G3、 6B8、 10G10、 9F3、 3F11、 8B10。取8G3细胞株制备腹水来源的mAb， 以Western blot法鉴定， 显示抗体8G3的特异性。

　　3 讨论
　　
　　本实验中通过建立稳定表达IGF1R的3T3细胞系， 将该细胞系进行免疫小鼠， 通过杂交瘤技术筛选出高效价的8G3株mAb。用Western blot鉴定稳定表达IGF1R 3T3细胞系， 发现Mr在200 000有1条明显的条带， 据文献［7］报道， 该条带是IGF1R的前体， 没有经过剪接， 据推测， 可能是受IGF1R的过表达或表达载体上ETag标签对其转录后剪接的影响。已有研究表明HeLa细胞高表达IGF1R［8］， 因此我们提取HeLa细胞蛋白， 采用Western blot检测抗体的特异性， 发现在Mr 130 000处有1条明显的条带， 表明该mAb能够与IGF1R胞外区的α亚基发生特异性结合。在Mr 130 000条带下方的微弱条带， 应该是IGF1Rα亚基未能完全糖基化的产物［9］。特异性IGF1R mAb的制备， 为以IGF1R为靶向的肿瘤治疗打下基础。

参考文献

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　　［5］ 余 抒， 罗 萍， 陈洪章， 等. 抗肠出血性大肠杆菌0157: H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（7）: 657-659.

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　　［9］ SeppLorenzino L. Structure and function of the insulinlike growth factor I receptor［J］. Breast Cancer Res Treat， 1998， 47(3): 235-253.