BrdU标记检测大鼠垂体前叶细胞的增殖功能

　　　　作者：胡玉珍， 赵玉峰， 张万会， 张庆红*， 冯娜， 张海峰

【摘要】 　　目的: 为了观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞的增殖水平， 建立一种快速、 准确、 灵敏、 无同位素污染的检测垂体前叶细胞增殖的方法。方法: 应用原代培养大鼠垂体前叶细胞， 加入5溴2脱氧尿嘧啶(BrdU)标记细胞增殖， 用抗BrdU抗体进行免疫细胞化学染色， 观察大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力。结果: 大鼠垂体前叶细胞可见BrdU阳性标记内分泌细胞， 其细胞核内可见棕褐色阳性颗粒， 核浆比例增大， 呈颗粒状， 提示处于细胞增殖期。免疫细胞双重染色表明， 体外培养垂体前叶的生长激素细胞、 催乳素细胞、 促肾上腺皮质激素细胞均具有一定的增殖能力。结论: BrdU标记是一种有效的标记垂体前叶细胞增殖的方法， 为探究大鼠垂体前叶细胞中各类激素细胞增殖能力提供了理论基础。

【关键词】 5溴2脱氧尿苷(BrdU); 细胞培养; 免疫细胞化学; 垂体; 大鼠

　　垂体前叶由多种类型的内分泌细胞组成， 包括生长激素（GH）、 催乳素（PRL）、 促肾上腺皮质激素（ACTH）、 促甲状腺激素（TSH）、 促性腺激素（LH/FSH）等细胞［1］。用普通的形态学方法难以区分这些细胞类型， 检测各种类型内分泌细胞的增殖状态十分困难。目前检测垂体前叶细胞增殖活动常用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)掺入法。由于3HTdR为放射性标记物， 操作复杂， 且需要接触同位素， 使其应用受到限制。另外3HTdR掺入法不能明确各种类型细胞的增殖情况。5溴2脱氧尿苷(5Bromo2deoxyuridine， BrdU)与胸腺嘧啶核苷（TdR）具有相似的结构， 该物质能取代胸腺嘧啶掺入S期细胞新合成的DNA链内［2］。 因此， 可采用BrdU替代3HTdR掺入垂体前叶细胞， 用抗BrdU抗体染色， 进行细胞的增殖功能测定。此方法的成功建立将十分有利于明确各种类型内分泌细胞的增殖状态。对此， 目前报道甚少。本实验初步建立了5溴脱氧尿苷标记的免疫细胞化学方法， 用于检测大鼠垂体前叶细胞中各类细胞的增殖功能。该方法能达到与3H标记检测的同样效果［3］， 而且比3H标记法更为快速、 安全和简便， 为进一步探讨垂体前叶细胞的增殖提供了理想的实验方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 DMEM培养基为Gibco公司产品; BrdU， 小鼠抗BrdU mAb和ABC复合物均购自Sigma公司。雄性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 垂体前叶细胞原代培养 SD大鼠经10 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后， 迅速浸入750 mL/L酒精中5～10 min， 在无菌条件下开颅取出大鼠垂体， 小心去除后叶。垂体 前叶经0.01 mol/L PBS冲洗后， 用眼科剪切成≤1 mm3组织块， 置入10 mL 1.25 g/L胰蛋白酶中进行消化， 于37℃振荡温育30 min， 用吸管吹打分散细胞。将细胞悬液吸入加有完全培养液的离心管， 终止消化; 未完全消化的组织再重复消化1次， 合并细胞悬液， 经100目尼龙网过滤， 1 000 r/min， 离心10 min， 弃掉上清， 滴加DMEM培养液（含有10 mL/L 小牛血清）使垂体前叶细胞重悬并分散， 镜检计数。将细胞密度为4×108/L的细胞悬液滴于24孔培养板内的自制小盖玻片上（用多聚赖氨酸包被）， 待细胞悬液布满小盖玻片后， 每孔加400 μL DMEM培养液， 置于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中进行培养。

　　1.2.2 BrdU标记 细胞培养48 h后， 用BrdU标记大鼠的垂体前叶细胞.培养板内加入终浓度为2.5 mmol/L的 BrdU， 继续培养12 h后终止培养， 将贴有细胞的小盖玻片取出进行染色。

　　1.2.3 免疫细胞化学染色检测 将贴有细胞的小盖玻片用0.01 mol/L PBS 洗1次， Bouin’s液固定20 min， 0.01 mol/L PBS漂洗3次， 3 mL/L Triton X100浸15 min， 0.01 mol/L PBS 洗3次， 2 mol/L HCl处理20 min， 冲洗后以正常的兔血清（1∶20）封闭1 h， 滴加小鼠抗BrdU单抗（1∶500）4℃过夜。次日用ABC法常规染色， 硫酸镍铵加强法显色。

　　1.2.4 BrdU双标记 将BrdU标记阳性的大鼠垂体前叶细胞， 分别滴加抗垂体前叶激素的抗体， ACTH、 PRL、 GH稀释为(1∶500)， 4℃过夜。次日常规ABC法染色， DAB 显色。逐级酒精脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封片。

　　1.2.5 对照实验 阳性对照为BrdU标记的大鼠垂体前叶细胞， 阴性对照不加BrdU标记的大鼠垂体前叶细胞， 空白对照以0.01 mol/L PBS或正常兔血清取代第一抗体。

　　2 结果

　　2.1 BrdU标记的阳性细胞 BrdU标记的大鼠垂体前叶阳性细胞核呈棕褐色颗粒着色， 细胞体积明显增大， 胞质丰富， 核浓染， 呈颗粒状， 核浆比例增大。BrdU能掺入细胞核内， 掺入的阳性细胞呈黑蓝色颗粒， 体积增大， 胞质丰富。大鼠垂体前叶细胞吸收BrdU后， 核膜、 核内染色质及核仁均有阳性反应， 高倍镜下可见被标记的细胞核内染色体双螺旋结构解开， 成平行排列结构， 还可见到正处于复制阶段的X型染色体， 表明BrdU标记的大鼠垂体前叶阳性细胞正处于S增殖期（图1）。

　　2.2 BrdU标记的S期中各期阳性细胞 标记的BrdU阳性细胞， 高倍镜下可见细胞核内染色体双螺旋结构解开， 呈平行排列， 表明该类细胞正处于DNA合成的S期。当核内颗粒少， 大小一致， 核仁可见， 表明细胞处于S早期。当核内颗粒较大， 数量较多， 弥散分布， 核仁不见， 表明细胞处于S中期。颗粒数量少， 但数量较大， 大小不一致， 分布不均表明， 细胞处于S晚期。 大鼠垂体前叶细胞的各类内分泌细胞被标记呈阳性的S期细胞数量不等， 显示出各类内分泌细胞有不同的增殖能力（图２）。

　　图1 BrdU标记的垂体前叶阳性细胞（×200）（略）

　　图2 BrdU参入细胞S期颗粒的分布情况（×400）（略）

　　A: S早期颗粒小; B: S中期颗粒较大; C: S晚期颗粒粗大.

　　2.3 透射电镜观察 大鼠垂体前叶细胞核内可见大量的绒毛膜增生， 提示细胞功能活跃， 处于增殖状态。细胞出现凹陷， 内分泌细胞有分泌颗粒出现， 说明细胞分泌功能旺盛（图３）。细胞增殖周期中S期是DNA合成期， 此期细胞内DNA进行半保留复制， 需要各种合成DNA的原料掺入其中。BrdU为TdR（胸腺嘧啶）的类似物， 可参与细胞的合成。

　　2.4 BrdU标记的垂体前叶激素分泌细胞 垂体前叶不同种类的内分泌细胞具有一定的增殖能力， BrdU染色阳性细胞用不同激素的抗体进行双重染色， 结果表明， ACTH、 PRL、 GH分别和BrdU共存， 表明这些内分泌细胞均具有不同程度的增殖能力（图4）。

　　图3 电镜显示大鼠垂体前叶细胞中的内分泌细胞（×7 500）（略）

　　图4 BrdU和垂体前叶激素细胞双染结果 （×400）（略）

　　A: ACTH ; B: GH ; C: PRL.

　　3 讨论
　　
　　垂体前叶细胞类型多， 检测各种细胞的增殖一直是一个难题。我们采用BrdU免疫细胞化学染色的方法结合各种激素的免疫染色技术， 检测了不同类型垂体前叶细胞的增殖， 为深入研究垂体前叶细胞增殖功能提供了有力的手段。
　　
　　细胞增殖周期的S期是DNA合成期， 此期细胞内DNA进行半保留复制， 需要各种合成DNA的原料掺入其中。BrdU为TdR类似物， 能参与细胞DNA的合成， 在S期有效地掺入到DNA中［4］。因此， 用免疫细胞化学方法观察细胞内BrdU的掺入情况， 可了解DNA合成情况， 具有直观、 准确性高、 方法简便、 重复性好、 无放射性等优点， 同时可以结合双重染色的方法检测增殖细胞的类型。利用BrdU标记S期细胞的免疫细胞化学技术， 成败的关键是DNA的变性。只有使DNA变性， 双链充分解旋， 产生单链， 才能保证掺入DNA内的BrdU与特异性抗体结合。本研究中采用普通的2 mol/L HCl可以很好地使垂体前叶细胞的DNA变性， 暴露BrdU达到良好的免疫染色效果。BrdU掺入后 12 h即可观察到阳性细胞， 此时的阳性细胞核大， 核浆比例高， 说明正处于DNA合成的S期， 与何荣根等［5］的报道一致。有报道用BrdU标记小鼠睾丸和小肠细胞， 其结果与3H TdR标记的结果完全一致［6］。同样， 本实验采用BrdU标记观察大鼠垂体前叶细胞的增殖方法， 也可以准确地检测垂体前叶细胞增殖的能力。
　　
　　总之， 体外培养垂体前叶细胞具有一定的增殖能力。GH、 ACTH和PRL等细胞均有BrdU阳性染色。这说明本实验建立的BrdU染色可以用于准确检测垂体前叶细胞增殖的能力。

参考文献

　　［1］ 迟素敏. 内分泌生理学［M］. 西安: 第四军医大学出版社， 2006:47.

　　［2］ 葛振华， 王若愚， 王长青. 用抗溴脱氧尿苷单克隆抗体检测小鼠各种器官内S期细胞分布的研究［J］. 解剖学报， 1994， 25(1):51-55.

　　［3］ 晏 炬. 抗BrdU单克隆抗体技术［J］. 国外医学·分子生物学分册， 1993， 15(2):72-75.

　　［4］ Migheli A， Mocellin C， Giordane MT. Ultrastural detection of DNAincorporated bromodeoxyuridine in resin embedded brain tissue［J］. Histochem， 1991， 95(6):491.

　　［5］ 何荣根， 徐宏波， 田中昭男， 等. 正常大鼠深处腺组织细胞增殖能力的观察［J］. 中华口腔医学杂志， 1996， 31(1): 67-70.

　　［6］ Thoolen B. BrdU labelling of Sphase cells in testis and small intestine of mice， using microwave irradition for immunogold silcer staining: An Immunocytochemical study［J］. J Histochem Cytochem， 1990， 38(2):267.