TALL患者外周血TCRγ/δ T细胞的分布和增殖特点

　　　　 作者：查显丰， 李扬秋， 陈少华， 杨力建， 李萡， 郁志

【摘要】 　　目的: 了解T细胞急性淋巴白血病（Tcell acute lymphocytic leukemia， TALL）患者外周血TCR Vγ和Vδ亚家族T细胞的分布和克隆情况。方法: 利用RTPCR扩增9例TALL患者和10例正常人外周血单个核细胞中3个TCR Vγ和8个Vδ亚家族基因的互补决定区3（CDR3）， 了解TCR亚家族Vγ和Vδ亚家族细胞的分布; 阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度， 从而了解其克隆性。结果: 9例TALL患者3个Vγ亚家族的表达率都明显低于正常人Vγ亚家族的表达率（P&<0.05）; V δ亚家族中只有Vδ1和Vδ3的表达率低于正常人（P&<0.05）。3例TALL患者出现克隆性增殖的γ/δ T淋巴细胞。结论: TALL患者外周血TCR Vγ和部分Vδ亚家族谱系出现限制性表达和克隆性增殖。同时存在克隆性增殖γδ+ T细胞提示可能为γδ+白血病性T细胞克隆。

【关键词】 T细胞急性淋巴细胞白血病; T细胞受体Vγ基因; T细胞受体Vδ基因; 克隆性

　　T细胞受体（T cell receptor， TCR）是T细胞识别外来抗原并与之结合的特异性受体， TCR 包括有α、 β、 γ和δ四种肽链， 以两种形式存在， 它们是由二硫键连接的异二聚体包括α/β， 或γ/δ蛋白链。在前T细胞中， TCR γ和δ基因处于无功能的胚系结构状态， 在它们分化成熟的过程中发生重排形成功能性TCRγ和δ基因， 每一个TCR胚系基因包括可变区（V区）、 结合区（J区）和恒定区（C区）等基因片段， 其中TCRδ基因还包含多样区（D区）。TCRγ和δ基因它们在重排过程中形成一高度可变区VN（DN）J区（TCRγ没有D区）称为互补决定区3（complementarity determining region 3， CDR3）， 是识别抗原的区域， 由于N区插入的长短不同， 不同重排（不同克隆）的CDR3长度不同。根据这一特点， 通过检测Vγ和δ亚家族的CDR3长度， 可以了解机体T细胞不同亚家族的分布及其克隆性［1］。我们前期研究发现TALL患者存在TCR Vβ亚家族单克隆T细胞， 可能为肿瘤性克隆， 但也在部分患者中未能检测到克隆性增殖T细胞， 考虑可能存在其他类型的TALL［2］， 故本研究进一步分析TALL患者外周血单个核细胞中Vγ和Vδ亚家族的分布及其克隆性增殖等情况。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 经细胞形态学、 组织化学和细胞免疫学准确诊的TALL患者9例（编号S1～S9）， 年龄4～71岁（中位年龄21岁）， 其中男7例， 女2例。肝素抗凝收集各样本外周血， 常规方法分离单个核细胞， 10例正常人作为对照。RNAzol试剂盒购自Gibco/BRL公司; 随机引物和反转录酶试剂盒（PowerScriptTM Reverse）购自美国BD公司; Taq聚合酶分别购自Promega公司; 高质量的去离子甲酰胺(HiDiFormamide)、 GeneScan500(LIZ) Size STD Kit和POP4(Performance Optimized Polymer4)胶均购自美国PerkinElmer公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RNA提取和cDNA合成 按常规方法用RNAzol试剂盒提取所收集的外周血单个核细胞的RNA， 并应用随机引物和反转录酶试剂盒(PowerScriptTM Reverse)反转录合成cDNA第1链， 然后以RTPCR检测β2微球蛋白基因确定合成cDNA的质量。

　　1.2.2 RTPCR扩增

　　1.2.2.1 PCR引物设计 根据4个TCRγ亚家族（其中Vγ4为假基因， 不进行检测）， 设计3个上游引物（编号Vγ1Vγ3）， 在Cγ区设计一条共同下游引物记作Cγ［3］; 根据 8个TCRδ亚家族， 设计8个上游引物（编号Vδ1～Vδ8）， 在其Cδ区上设一条共同下游引物记作C δ［4］; 并分别在下游引物Cγ和C δ的内侧设计一个荧光素标记的引物CγFam和Cδ Fam作为基因扫描和序列分析之用［4-6］， 引物由德国柏林TIB生物公司合成(表1)。

　　1.2.2.2 PCR扩增 PCR扩增按常规方法进行。总反应体系20 μL其中含1 μL cDNA产物， 任一上游引物和其对应引物(0.5 μmol/L)， 0.1 mmol/L dNTP， 1.25 U Taq聚合酶， 1×PCR缓冲液， 同时设置阳性和阴性对照。反应在PCR扩增仪(Biometra， 德国)中进行， 共进行40个循环， 94℃ 1 min (首次为3 min); 退火60℃ 1 min; 延伸72℃ 1 min(末次为10 min)， 反应结束后于4℃保存。PCR产物于25 g/L琼脂糖凝胶(溴化乙锭染色)中电泳分析结果［1］。

　　1.2.3 T 细胞克隆性分析

　　1.2.3.1 标记PCR产物 RTPCR产物经电泳分析出现阳性带者进一步以CγFam或Cδ Fam下游引物进行不对称扩增， 得到荧光标记的单链PCR产物。总反应体系为10 μL含2.5 μL首次PCR产物、 0.1 μmol/L CγFam或Cδ Fam引物、 2.5 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNTP、 PCR缓冲液和0.25 U Taq聚合酶， 共进行40个循环， 退火温度为66℃， 余同上［1］。

　　表1 用于RTPCR和基因扫描分析的引物序列（略）

　　1.2.3.2 基因扫描 取2 μL荧光素Fam标记的PCR产物加入高质量的去离子甲酰胺与GeneScan500(LIZ) Size Standard按20∶1比例配好的10 μL混合液， 经94℃变性4 min， 然后将样品加入96孔板， 直接装载到已灌好POP4胶的3100 DNA序列分析仪上进行电泳， 电泳所采集结果经基因扫描分析软件分析产物的长度和荧光强度， 所收集的不同位置和高度的表示产物的大小和含量， 峰的形态提示产物的克隆性。当PCR产物中所含的DNA扩增片段大小一致， 其电泳时的迁移率完全相同， 在同一时间通过扫描， 所显示的结果为一单峰图像， 提示PCR产物自TCR Vγ或Vδ的CDR3序列完全相同的T细胞， 即克隆性细胞， 而一主峰和少数小峰图像提示产物主来自同一克隆即为寡克隆性， 双峰图像提示双克隆性， 多峰图像提示多克隆性， 图像介于多克隆性与寡克隆性图象之间呈一主峰明显高于其他峰的图象有向寡克隆发展趋势提示寡克隆增殖趋势［1］。

　　1.2.4 统计学分析 用χ2检验分析试验数据。

　　2 结果

　　2.1 TCR V γ和V δ亚家族表达特点

　　2.1.1 TCR V γ亚家族表达情况 在10例正常人外周血中Vγ1、 Vγ2和Vγ3亚家族表达率分别是10/10例(100%)、 10/10例(100%)和9/10例(90%)， 而在9例TALL患者外周血中它们表达率分别为1/9例(11.1%)、 1/9例（11.1%）和2/9例（22.2%）明显低于正常人（P&<0.05）。在TALL患者外周血中Vγ亚家族呈现明显的限制性表达（图1）。

　　2.1.2 TCR V δ亚家族表达情况 TCR V δ4和V δ5亚家族在正常人和TALL患者外周血中都未检测其表达; V δ6亚家族仅分别在TALL和正常人样本中检测到; 在TALL患者外周血中V δ1（3/9例）、 V δ2（7/9例）、 V δ3（1/9例）、 V δ7（0/9例）和V δ8（1/9例）亚家族表达率分别低于正常人外周血中V δ1（10/10例）、 V δ2（10/10例）、 V δ3（9/10例）、 V δ7（1/10例）和V δ8（3/10例）， 但只有V δ1和V δ3亚家族在TALL外周血中表达率低于正常人有统计学意义（P&<0.05， 图1）。

　　图1 TALL患者（9例）和正常人（10例）外周血T细胞TCR Vγ和Vδ亚家族的表达率（略）

　　2.2 T细胞克隆性分析结果 9例TALL患者中有S3、 S4和S5 3例患者外周血单个核细胞中出现1～4个寡克隆性、 双克隆性或克隆性增殖趋势的γ/δ T淋巴细胞， 其中S3仅出现Vγ1、 Vδ1、 Vδ2和Vδ8等4个亚家族都呈寡克隆性增殖; S1和S7患者未检测出γ/δ T淋巴细胞; 其余病人的γ/δ T淋巴细胞呈多克隆性（图2， 表2）。在10例正常人中都出现寡克隆性、 双克隆性或克隆性增生趋势的γ/δ T淋巴细胞， 但大多数还是呈多克隆性增殖。

　　图2 TALL患者(2例)Vγ和Vδ亚家族PCR产物基因的扫描分析（略）

　　3 讨论
　　
　　γ/δ T 淋巴细胞虽然只占外周血T淋巴细胞的3%～5%［7］， 但是由于它与α/β T 淋巴细胞相比具有在感染后能够更迅速的增殖、 能调节CD4+和CD8+ T 淋巴细胞的功能、 不需要抗原提呈直接识别抗原等能力［8］， 在机体抗肿瘤方面起着不可忽视的作用。在TALL中， 多数TALL的肿瘤性T细胞来源于αβ+T细胞肿瘤， 但有小部分可能来源于γδ+T细胞肿瘤［9］。本课题组前期研究已经发现了TALL相关的单克隆性T细胞和一些寡克隆增殖T细胞［2］， 但仍有部分患者未能检测到克隆性增殖TCR Vβ T细胞， 推测可能是来源于γδ+T细胞肿瘤。故本研究进一步分析TALL患者中， TCR Vγ和Vδ亚家族的表达和T细胞克隆性特点。

　　表2 TALL患者和正常人TCR Vγ和Vδ亚家族的表达和克隆性（略）

　　P: 多克隆性; B: 双克隆性; O: 寡克隆性; OT: 寡克隆增殖趋势.

　　本研究显示仅在4/9例TALL中可以检测到1个TCR Vγ 亚家族的表达， 与正常人几乎全部TCR Vγ 亚家族有明显的差异。在正常人中， 几乎全部表达Vδ1， Vδ2和Vδ3， 但在TALL中， 除了Vδ2可见于7/9例患者外， V δ1和V δ3的表达频率明显低于正常人， 这种表达模式的差异与TCR Vβ基因谱系变化相似［9］， 可能存在两种原因， 一种是肿瘤细胞对其产生的抑制作用， 另一种是由于肿瘤克隆的大量扩增使正常T细胞的数量相对减少。
　　
　　理论上讲， 机体未受任何抗原刺激， 其TCR基因的重排是随机的， 表现为多家族和多克隆性， 而当其受到肿瘤抗原等相应抗原刺激后TCR谱系会呈现优势利用并出现克隆性改变［1］， 一般来说， 在TCR Vβ亚家族中所发现正常情况下， 全部亚家族T细胞呈多克隆性增殖［10］。但与Vβ亚家族不同， TCR在TCR Vγ和Vδ亚家族中， 则在正常人中也常可检测到寡克隆性的T细胞， 同时随着年龄增加而明显［11］。本研究在部分正常人外周血T细胞中可发现TCR Vγ和Vδ亚家族的克隆性增殖T细胞， 尤其是以Vδ2亚家族最常见（7/10例）。因此， 分析TCR Vγ和Vδ亚家族T细胞克隆性并非作为分析TALL相关的抗原特异T细胞， 而是通过该研究了解可能存在的γδ+白血病性T细胞克隆。从本研究结果可以发现， 在2例TALL（S3和S5）中， 同时在Vγ和Vδ发现克隆性增殖T细胞， 提示γδ+白血病性T细胞克隆的可能性。该结果也与我们前期研究在绝大多数TALL中可发现αβ+白血病T细胞克隆， 而在小部分病例中未能检测到T细胞克隆的结果想吻合， 但还需要进一步分析这些克隆性增殖T细胞的基因序列， 以及鉴定其肿瘤性。
　　
　　总之， 本研究中首先分析了TALL患者外周血T细胞中TCR Vγ和Vδ亚家族基因的表达模式， 并初步发现可能与TALL肿瘤相关的克隆性γδ+T细胞， 为进一步了解TCR Vγ和Vδ亚家族在TALL表达和克隆性增殖规律等提供相关资料。

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