IL27基因转染对小鼠结肠腺癌细胞生物学特性的影响

　　　　 作者：杨丽娟， 胡洁， 白利锐， 吴丽娜， 魏林

【摘要】 　　目的: 获得稳定表达小鼠IL27(mIL27)基因的小鼠结肠腺癌细胞株(Colon26)， 研究IL27基因对小鼠结肠腺癌细胞体内外生物学特性的影响。方法: 通过脂质体法将pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒转染结肠腺癌细胞， 筛选建立高表达细胞株。采用Western blot、 ELISA、 RTPCR法证实IL27基因成功转染Colon26。用MTT比色法检测IL27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响; 流式细胞术检测IL27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响; 将Colon26IL27细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下， 观察其致瘤性。结果: Colon26IL27细胞可表达IL27mRNA并分泌IL27， IL27的表达在体外对Colon26细胞的增殖、 凋亡均无影响， 而在体内则具有明显的抗瘤活性。结论: 成功制备Colon26IL27细胞株， 证明IL27能在体内明显抑制肿瘤的生长， 延长荷瘤小鼠的生存期， 具有一定的抗肿瘤作用。

【关键词】 白细胞介素27; 基因转染; 结肠癌

　　白细胞介素27（Interleukin 27， IL27）是2002年发现并命名的IL6/IL12家族成员， 由p28和EBI3两个亚基组成， 可作用于固有性免疫和适应性免疫系统的多种免疫细胞而发挥广泛的免疫调节作用。它在Th0向Th1分化的早期调节中起重要作用， 可促进Th1型细胞应答， 从而增强细胞免疫应答［1］。已知机体免疫系统的抗肿瘤效应机制以细胞免疫为主， 因此细胞因子IL27在增强抗肿瘤免疫为策略的生物治疗上应有重要的应用前景。本研究中我们将IL27(mIL27)基因转染小鼠结肠腺癌细胞(Colon26)， 并对转染后肿瘤细胞的生物学特征及致瘤性进行了观察， 为进一步深入研究IL27的抗肿瘤作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒由本实验室制备保存; 脂质体Lipofectamine2000、 G418为Sigma公司产品; TRIzol RNA提取试剂盒为GENERAY公司产品; 小鼠IL27基因和βactin引物均为上海生物工程公司合成。BALB/c小鼠（4周龄， 雌性）由河北医科大学实验动物中心提供。Colon26细胞为本实验室保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 IL27质粒脂质体法转染Colon26细胞 大量抽提pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒和pcDNA3.1HisB空质粒， 保存备用。转染前24 h用胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26细胞， 用无双抗、 无血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×109/L， 接种于24孔板， 每孔0.5 mL， 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。当细胞铺满孔底90%～95%时进行转染， 转染步骤参见说明书。转染Colon26细胞48 h后培养基中加入G418（200 mg/L）， 直至对照孔中的Colon26细胞完全死亡， 更换G418浓度（100 mg/L）继续筛选至细胞克隆形成， 挑取阳性克隆稀释扩增， 最终获得转入pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27或pcDNA3.1HisB的Colon26IL27细胞和Colon26HisB细胞。

　　1.2.2 Western blot检测IL27蛋白表达 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞， 裂解细胞， 离心取上清， 分别加入1×SDSPAGE 缓冲液， 煮沸10 min， 在125 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳; 电转移法将蛋白转移至硝酸纤维膜上， 50 g/L脱脂奶粉封闭后相继与抗小鼠HisB单克隆抗体（mAb）和兔抗小鼠的IgG碱性磷酸酶标记二抗反应， BCIP/NBT底物显色。

　　1.2.3 ELISA法检测IL27蛋白表达 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞， 裂解细胞， 离心取上清， 用包被液稀释后加入96孔板， 4℃包被过夜， 再用50 g/L脱脂奶粉37℃封闭1 h， 相继与抗小鼠HisB mAb和兔抗小鼠的IgG酶标记二抗各反应1 h， 底物显色30 min后测A450值。

　　1.2.4 RTPCR检测IL27的mRNA表达 自IL27中间段设计2条引物以检测IL27的mRNA表达， 检测产物长度860 bp， 上、 下游引物分别为: 5′TGTTGCTGCTACCCTTGCTTCTGG3′; 5′AAGGACGTGGATCTGGTGGAGTTG3′。βactin（619 bp）上、 下游引物分别为: 5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′; 5′GGAAGGAAGGCTGGAAG3′。胰酶消化分别收集Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞， 调细胞密度5×109/L， 按照TRIzol 总RNA 提取法提取细胞总RNA， 逆转录合成cDNA， 进行PCR扩增: PCR反应参数为: 94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s， 57℃ 1 min， 72℃ 1 min， 共30个循环; 72℃延伸 7 min。取 PCR反应产物10 μL， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.5 IL27质粒转染后对Colon26细胞生长曲线的影响 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞， 用含100 mL/L FBS的RPMI1640培养液重悬细胞， 每孔104个细胞接种于6块96 孔培养板中， 37℃、 50 mL/L　　 CO2培养箱中培养， 第2天始每日取1板， MTT法检测细胞的生长状况， 绘制细胞生长曲线。

　　1.2.6 流式细胞术（FCM）检测IL27质粒转染后对Colon26细胞凋亡的影响 胰酶消化收集处于对数生长期的Colon26IL27、 Colon26HisB及Colon26细胞1×106个， 冷PBS洗2次， 700 mL/L乙醇固定， 碘化丙啶染色， FCM检测各组细胞的凋亡曲线及凋亡蛋白BCL2蛋白的表达。

　　1.2.7 IL27质粒转染后对Colon26细胞成瘤性的影响 将小鼠随机分为3组， 即Colon26IL27细胞实验组、 Colon26HisB组、 Colon26组， 每组10只。收集处于对数生长期的Colon26IL27细胞、 Colon26 HisB细胞及Colon26细胞， 调整细胞密度为5×108/L， 于BALB/c小鼠背部皮下分别注射0.2 mL上述细胞悬液。从荷瘤第5天开始， 每隔3 d用游标卡尺测肿瘤大小， 肿瘤大小以体积（V）计算: V(mm3)=1/2×肿瘤最大直径×肿瘤最小直径2(mm3)。

　　1.2.8 统计学分析 数据统计分析由SASV8.0软件完成。

　　2 结果

　　2.1 转染pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27质粒细胞具有IL27蛋白表达 为证实pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27成功转染Colon26细胞， Western blot 检测IL27蛋白表达。结果显示， Colon26IL27细胞在目的位置出现特异性反应条带， 而Colon26HisB细胞和Colon26细胞则无此条带出现(图1)。

　　图1 Western blot 检测转染后各组细胞HisB的表达（略）

　　1: Colon26IL27细胞; 2: Colon26HisB细胞; 3: Colon26细胞.

　　ELISA法检测细胞裂解上清也支持了上述结果， 即转染IL27细胞组A值（0.812±0.045）明显高于转染HisB细胞组(0.127±0.009)以及作为对照的Colon26细胞(0.115±0.007)， 差异为具有统计学意义（P&<0.01）。由此说明Colon26IL27细胞可合成HisBIL27融合蛋白， pcDNA3.1(+)His(B)/mIL27成功转染Colon26细胞。

　　2.2 RTPCR证明IL27基因的转入以及mRNA的表达 分别提取Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞的总RNA， 经 RTPCR 扩增后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 在Colon26IL27细胞中可见1条约 860 bp 的 DNA 条带， 而 Colon26HisB、 Colon26 细胞中均未见到条带(图2)。

　　2.3 IL27质粒转染后对Colon26细胞生长的影响 取相同浓度Colon26IL27、 Colon26HisB细胞及Colon26 细胞连续培养5 d， 用MTT 法检测细胞A值， 结果显示， Colon26IL27细胞培养2 d、 3 d、 4 d、 5 d、 6 d的A值分别为0.896、 0.757、 0.698、 0.675、 0.610; Colon26HisB细胞培养2 d、 3 d、 4 d、 5 d、 6 d的A值分别为0.896、 0.615、 0.830、 0.700、 0.736; Colon26细胞培养2 d、 3 d、 4 d、 5 d、 6 d的A值分别为0.764、 0.612、 0.813、 0.950、 1.080， 3组细胞的A值无统计学意义。
　　
　　FCM检测结果表明， 3组细胞的凋亡百分率分别为1.01±0.15、 0.99±0.11、 1.43±0.19; BCL2蛋白表达的FI值分别为1.041±0.09、 1.087±0.181， 均无统计学意义， 说明IL27基因对Colon26细胞的生长和凋亡无影响。

　　图2 RTPCR检测IL27的mRNA表达（略）

　　M: DNA marker; 1: Colon26IL27细胞; 3: Colon26HisB细胞; 5: Colon26细胞; 2， 4， 6: βactin.

　　2.4 IL27质粒转染后对Colon26细胞成瘤性的影响 分别将Colon26IL27细胞、 Colon26HisB细胞和Colon26细胞接种于BALB/c小鼠背部皮下， 接种早期(8 d) Colon26/IL27细胞组肿瘤生长的速度及大小与Colon26细胞组相似， 8 d后， Colon26IL27细胞组的小鼠肿瘤生长速度变慢， Colon26IL27组与Colon26HisB细胞和Colon26细胞组相比均有明显的抑瘤作用（P&<0.05， 图3）。

　　图3 IL27对Colon26细胞成瘤性的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　细胞因子应用于抗肿瘤治疗， 取得了一定的效果， IL27因其可促进Th1型细胞应答、 增强细胞免疫功能而在肿瘤治疗中日益受到重视。本实验中我们将mIL27基因转染小鼠Colon26细胞， 经RTPCR检测证明在Colon26IL27细胞中有mIL27 mRNA的表达。ELISA法检测细胞裂解上清， 结果表明Colon26IL27细胞可分泌较高水平的mIL27， 提示Colon26IL27细胞中转入的IL27基因在mRNA水平和蛋白质水平均可表达， 质粒成功转染细胞。体外研究发现， Colon26IL27细胞与Colon26HisB细胞和Colon26细胞相比生长无统计学意义， 说明IL27的表达不能直接抑制Colon26细胞的生长。将Colon26IL27细胞接种于BALB/c小鼠皮下， 其致瘤性与Colon26HisB细胞和Colon26细胞相比明显降低， 肿瘤生长减慢， 体积小， 荷瘤小鼠生存期延长。上述结果提示， IL27可以在体内抑制Colon26肿瘤细胞的生长。Larousserie等报道称肿瘤细胞本身可能就是IL27的靶子［2］， 这与我们发现的IL27在体外并不直接抑制Colon26细胞的生长的结果不一致。
　　
　　综上所述， 我们的研究结果提示， IL27具有一定的抗肿瘤作用， 可以明显抑制肿瘤的生长， 延长荷瘤小鼠的生存期， Colon26IL27细胞株的建立， 为进一步深入研究IL27抗肿瘤作用的体内机制、 研制IL27肿瘤治疗疫苗奠定了基础。

参考文献

　　［1］ 杨丽娟， 胡 洁， 魏 林. 白细胞介素27的生物学作用［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（11）: 1094-1095.

　　［2］ Larousserie F， Bardel E， Pflanz S， et al. Analysis of interleukin27 (EBI3/p28) expression in EpsteinBarr virus and human Tcell leukemia virus type 1associated lymphomas: heterogeneous expression of EBI3 subunit by tumoral cells［J］. Am J Pathol， 2005， 166(4): 1217-1228.